第七章特殊毒性及其试验与评价方法.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,1DNA与基因,DNA由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构,。,遗传学基础,基因（gene）：DNA分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者,基因组（genome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质,General organization of the DNA sequence.Only the exons encode a functional peptide or RNA.The coding region accounts for about 3%of the total DNA in a human cell.,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,2、染色质与染色体,在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质。,它由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,3、基因型与表型,基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。,表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。,外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂,细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。,G,0,：,DNA,合成前期；,G,1,：,DNA,合成期；,S,：完成,DNA,复制；,G,2,：为有丝分裂做准备；,M,：有丝分裂期,有丝分裂过程,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,有丝分裂指细胞核分裂的过程，一个细胞由此生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,生殖细胞减数分裂过程,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过程称为,遗传,。,遗传的稳定是相对的。,在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为,变异。,一、基本概念,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,造成生物变异的原因有：,亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；,由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；,由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,遗传结构本身的变化及其引起的变异称为,突变。,自发突变的发生率极低，物种的进化与自发突变有密切关系,诱发突变是指人为地造成突变，它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,二、突变类型,遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤：,基因突变,染色体畸变,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损所致。,基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区别在于受损程度。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,通常以光学显微镜的分辨率0.2m来区分基因突变和染色体畸变。,基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可用光学显微镜进行观察。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,1.基因突变,基因突变指基因中DNA序列的变化。,因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。,碱基置换,碱基置换指,DNA,序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在,DNA,复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次,DNA,复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。,移码,移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。,整码突变,指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。,片断突变,指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,2.染色体畸变,指染色体的,结构异常和数目异常,，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,（1）染色体结构异常,有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，可在机体或细胞群传递。,容易观察到的畸变有,染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位,。,染色体畸变,裂隙(gap),断裂(break),断片(fragment)和缺失(deletion),微小体(minute body),无着丝点环,环状染色体,双着丝点染色体,倒位(inversion),易位(translocation),插入(insertion)和重复(duplication),辐射体,染色体结构变异类型,染色体,缺失,如果蝇的缺刻翅染色体,重复,如果蝇的棒状眼,染色体,倒位,染色体,易位,如夜来香的变异,裂隙,（gap）和,断裂,（break）,在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。,指染色体上狭窄的非染色带，无线状连接者为断裂。带宽超过染色单体宽度。,无着丝粒断片,（fragment）、,缺失,（deletion）,一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。,环状染色体,（ring chromosome）,染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。,倒位,（inversion）,当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180,再重接，称为 倒位。,插入,（insertion）和,重复,（duplication）,当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。,如果此时有缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。,易位,（translocation）,两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。,（2）染色体数目异常,整倍性畸变：,单、三、四、多倍体,非整倍性畸变：,2倍体多一条或少一条或多多条或少多条,2n-1,2n-2,2n+1,2n+2,类型,公式,染色体组,整倍体,单倍体,n,(ABCD),二倍体,2n,(ABCD)(ABCD),三倍体,3n,(ABCD)(ABCD)(ABCD),四倍体,4n,(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD),非整倍体,单体,2n-1,(ABCD)(,ABC,),三体,2n+1,(ABCD)(ABCD)(,A,),四体,2n+2,(ABCD)(ABCD)(,AA,),双三体,2n+1+1,(ABCD)(ABCD)(,AB,),缺体,2n-2,(,ABC,)(,ABC,),染色体数目异常的基本类型,注：A、B、C、D代表非同源染色体,三、突变的发生与修复机制,外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是,DNA,，而导致染色体数目异常的靶部位主要是,有丝分裂和减数分裂器,，如纺锤丝。,DNA修复,直接修复,切除修复,O,6,甲基鸟嘌呤修复,光修复,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,复制后修复,呼救性修复,致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。,致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。,四、致突变试验与致突变作用评价,观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的：,检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；,检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,常用的致突变试验,1、细菌回复突变试验（Ames试验）,2、哺乳动物细胞基因突变试验,3、果蝇伴性隐性致死试验,4、染色体畸变分析,5、微核试验,6、姐妹染色单体交换试验,7、显性致死试验,8、小鼠可遗传易位试验,9、细菌DNA修复试验,10、程序外DNA合成实验,11、精子畸形试验,12、小鼠特异基因座试验,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,1、细菌回复突变试验,细菌回复突变试验是以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。,试验菌株：,鼠伤寒沙门氏菌,Ames,试验,大肠杆菌大肠杆菌回复试验,Ames试验原理：,检测受试物诱发,鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-),回复突变成野生型(his+)的能力。,试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养琼脂平板上不能生长。,突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变成野生型(his+),，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此平板上生长成可见菌落如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。,鼠伤寒沙门氏菌原养型(his,+,),组氨酸营养缺陷型突变株(his,-,),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,有点试验和掺入试验两种。应分别进行不加及加代谢活化系统的试验，常用为S9混合液，即用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆经9000g离心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子。,2.哺乳动物细胞基因突变试验,(mammalian cell gene mutation assay),哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。,常用细胞株 选用的基因座,小鼠淋巴瘤细胞L5178Y TK、HPRT,中国仓鼠卵巢组织细胞CHO HPRT,中国仓鼠肺组织细胞V79 HPRT,人淋巴细胞 HPRT,（1）,TK,基因座,TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷ATP 胸苷酸。,存在嘧啶类似物5-溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。,受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。,（,2,）HPRT基因座,次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖焦磷酸 核苷-5-单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。,加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变HPRT,-,。,3、染色体畸变试验,制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogenetic assay)。,染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。,体内试验,：多观察,骨髓细胞,，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、,DNA,修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。,体外试验,：常用,中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和V,79,等细胞系,，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞。,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,4、微核（micronucleus）试验,微核是染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的,子细胞胞浆内,形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。,常用啮齿类动物,骨髓嗜多染红细胞,(PCE),或,外周血细胞,进行微核试验。,PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。,一般采用多次染毒后24h采样。,MN,NCE,Illustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus(arrow).Nuclear material appears in yellow,cytoplasm in red.Acridin-Orange staining,fluorescence microscopy,enlargement 1000 fold,单个微核,多个微核,5.显性致死试验(dominant lethal assay),显性致死指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。,一般认为显性致死主要是由于染色体损伤的结果。,显性致死试验以,胚胎死亡,为观察终点，,用于检测受试物对动物性细胞的染色体损伤作用。,一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。,6、程序外DNA合成试验(unscheduled DNA synthesis test，UDS),当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有,3,H-胸腺嘧啶核苷,的培养液中进行培养。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。,7、小鼠精子畸形试验,精子畸形指精子形态发生异常改变。可导致生育能力的改变。用于检测外源化学物对精子生成和发育的影响，也可用于评价化学物对生殖细胞的致突变作用。,常用68周的小鼠，连续5天染毒。在染毒后不同时间（1、4、10周）处死，取样检查精子形态。,精子形态,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,五、致突变试验中的一些问题,1、阴性、阳性对照的设立,（1）阴性对照 即未处理对照或溶剂对照。,（2）阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。,2、体外试验的活化系统,许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物,3、致突变试验与致癌试验的关系,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一内容,回主目录,遗传毒性和致癌性分类：,致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物。,我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序(2003)中对遗传毒理学试验的要求是：,考虑原核细胞与真核细胞、体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则。从,Ames试验或V79/HGPRT基因突变试验,、骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、,TK基因突变试验、小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析,选一项。,其他备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、非程序性DNA合成试验。,1.如三项试验中，体内、体外各有一项或以上试验阳性，则表示该受试物很可能具有遗传毒性和致癌作用，放弃。,2.如三项试验中一项体内试验阳性或两项体外试验阳性，则再选两项备选试验（至少一项体内试验）。如再选的试验均为阴性，则可继续将进行下一步的毒性试验；如其中有一项试验阳性，则结合其它试验结果，经专家讨论决定，再做其它备选试验或进入下一步的毒性试验。,3.如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。,