核酸分子杂交技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,核酸,分子杂交,技术：,具一定同源性的两条(DNA或RNA),单链,在适宜的温度及离子强度等条件下,可按,碱基互补配对原则,特异性地复性，形成,双链,探针,(序列已知，,单链,),待测核苷酸序列,(,单链,),主要内容,第一节 分子杂交技术的理论基础,第二节 核酸分子杂交的方法,第三节 核酸杂交的探针,核酸分子杂交技术：,1968,年,华盛顿卡内基学院,（Carnegie Institute of Washington）的,Roy Britten,及其同事发明的,第一节 分子杂交技术的理论基础,变性,复性,DNA-DNA,杂交双链分子,关键步骤,：,变性杂交（复性）-检测信号结论,信号的采集与处理,结论,一、DNA变性与复性,（一）DNA变性,1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的,氢链断裂,变为单链的过程，称DNA变性,2、变性的方法：,1）,热变性,：温度升高到90100时，双链核酸,分子链间的氢键完全断裂。,2）,酸碱变性,：pH值低于3或高于10时，双链核酸,分子链间的氢键断裂。,3）,化学试剂变性,：如尿素、甲酰胺、甲醛等使,双链核酸分子链间的氢键断裂,3、核酸溶液变性后的理化性质变化：,粘度降低,密度增加,紫外吸收值增加,(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程),4、DNA变性曲线,AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的,变性DNA/总DNA,Tm值：,50%DNA分子发生变性的温度（即熔解曲线中点对应的温度），,这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature,Tm）,Tm,是指消光值上升到最大消光值一半时的温度,5、GC含量与Tm值,(melting temperature),之间的关系,（G+C）%=（Tm-69.3)2.44,Tm=(G+C)%0.41+69.3,Tm,不是一个固定的数值，它与很多因素有关：,pH值离子强度,和,DNA的碱基比例,DNA制剂,不应保存在离子强度过低的溶液中，,一般保存在1mol/l NaCl,溶液中较稳定,（二）复性,1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。,具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：,DNA/DNA,、,RNA/DNA,、,RNA/RNA,、,寡核苷酸/DNA,和,寡核苷酸/RNA,。,2、复性过程,1）单链分子间碰撞,形成局部双链,2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离,局部双链周围的碱基如配对，则,形成中心序列,3）形成,完整的双链分子,3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）,dC,dt,=K,2,C,2,（1）,将（1）积分,C,C,o,1,1+K,2,C,o,t,=,（2）,一半单链DNA分子复性时，（2）式中的 为,1,2,1,2,1,1+K,2,C,o,t,=,C,o,t,1/2,值越大，复性速度越慢,C,C,o,（3）,1,K,2,C,o,t,1/2,=,二、影响杂交的因素,1、核酸分子的浓度和长度：,浓度越大,，复性速度越快,分子越大,，复性速度越慢,单链探针,，浓度增加，杂交效率增加,双链探针,，浓度控制在0.1-0.5g,浓度过高影响杂交效率,2、温度：,（1）,DNA/DNA,杂交，适宜温度较Tm值低20-25,（2）,RNA/,DNA,或,RNA,/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值,（原位杂交时，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而 引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落）,（3）,用寡核苷酸探针杂交,，适宜温度较Tm值低5,3、离子强度：,（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加,（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,（当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度）,4、甲酰胺：,甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定,（1）当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35,42 杂交,（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,5、核酸分子的复杂性：,（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，Cot与反应体系中核酸复杂性成正比,（Cot,1/2,值越大，复性速度越慢）,（2）两个DNA样品浓度绝对一致时，,变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,6、非特异性杂交反应：,（1）杂交前,封闭非特异性杂交位点,，减少其对探针的非特异性吸附,（2）,常用的封闭物,有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,膜上印迹杂交,原位杂交,RNA酶保护分析法,核酸酶S1保护分析法,第二节 核酸分子杂交的方法,按待测核酸是否固定在固相支持物上分：,固,-,液相杂交,液相 杂交,核酸分子杂交实验步骤：,印迹转移,：将核酸样品转移到固相支持物滤膜上,主要三种方式：毛细管虹吸作用,真空抽滤作用,电场作用,杂交,：将具有核酸等样品印迹的滤膜同带有放射性标记或其他标记的DNA或RNA探针杂交,2、常用的印迹转移方法（Southern blot）,1）,毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上,2）,电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上,3、同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,1、转移缓冲液中含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠,2、,上层吸水纸,的虹吸作用使缓冲液通过,滤纸桥,、,滤纸,、,凝胶,、,硝酸纤维素滤膜,向上运动,3）,真空转移法,原理与毛细管虹吸法相同,不同点：滤膜在下，凝胶在上,的方式,将其放置在一个真空室上，,利用真空作用,将,转膜缓冲液,从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上,Southern DNA印迹杂交,Edwin Mellor Southern,Southern DNA印迹杂交,使在电泳凝胶中分离的,DNA片段,转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。,E.Southern于1975年首先设计出来的，故又称：,Southern blot,Southern 印迹杂交的主要流程,1）待测核酸样品的制备,1、裂解或破碎细胞,2、抽取纯化基因组DNA,3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,2）待测DNA样品的电泳分离,1、琼脂糖浓度,：,分离大片段用低浓度胶,分离小片段用高浓度胶,2、凝胶电泳,：,凝胶具有分子筛效应，大分子,DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，,大小相同的分子处于同一条带,3、分子量标准,：,经Hind消化的DNA，杂交,所用分子量标准可用核素标记,3）凝胶中核酸的变性（碱变化）,凝胶置于,NaOH溶液中,使DNA变性为较短的单链 DNA,然后置于 中性缓冲液 或者 凝胶缓冲液 之中,4）Southern印迹,指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程,理想的固相支持物应具备的特性,具有较强结合核酸分子的能力,不影响与探针的杂交反应,与核酸分子结合稳定牢固,具有良好的机械性能,非特异吸附少,常用的固相支持物(滤膜),尼龙滤膜,硝酸纤维素滤膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）,二乙氨乙基纤维素滤膜（DEAE）,特点：进行核酸杂交时，滤膜容易 操作和保存,（与凝胶相比）,滤膜的选择,核酸的特殊性、分子大小,杂交过程中所涉及的步骤的多寡及敏感性等参数,硝酸纤维素滤膜,：不能滞留小于150bp的DNA片段,不能同RNA结合,广泛变性后的RNA很容易转移到硝酸纤维素滤膜,（P.S.Thomas,1983）,改变缓冲液可以改善硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力,(G.E.Smith,1980:1mmol/L,CH,3,COONH,4,和0.2mmol/L NaOH缓冲液代替SSC,),尼龙滤膜,较为理想的固相支持物,结合核酸能力强,转膜后可多次重复使用（,每次杂交的探针可以洗去而结合的DNA酶切片段不容易被洗去,）,缺点：杂交信号的本底较高,5）Southern杂交,1、预杂交：封闭,膜上,能与DNA结合的位点,预杂交液为不含DNA探针的杂交液,2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交,双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交,3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA,6）杂交信号检测,1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针,2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片,水稻（,Oryza sativa L,.)的叶绿体DNA分别用,核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）,消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同,32,P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列,利用非放射性探针检测核苷酸生物素（biotin）-抗生物素蛋白（avidin）,抗生物素蛋白,（a）,（b）,（c）,（d）,（e）,基因组DNA,DNA限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因DNA片段,X光底片,Southern blot,操作流程,7）Southern杂交的应用,1、酶切图谱分析,2、特定基因定性和定量,3、基因突变分析,4、限制性片段长度多态性的分析,Northern blot,1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将,RNA分子,从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法,因此法与Southern blot杂交技术十分类似，故叫做,Northern blotting,Northern印迹杂交,1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同,2、鉴别RNA,3、探针可用DNA或RNA片段,4、待测样品为总RNA或mRNA,Northern印迹与Southern 印迹的不同点,1、变性：,RNA电泳前加热变性,、,电泳时加变性剂,保,持RNA处于变性状态，避免单链RNA自身形成高级结,构和自身降解,变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)+,RNase抑制环境,，DNA电泳前和电泳中不变性,2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern,印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理,3、靶核酸为RNA,Western印迹杂交,检测的蛋白质经PAGE凝胶电泳并染色后，转移到滤膜上固定，然后用“抗原-抗体”免疫反应或“DNA-Protein”结合反应来鉴别滤膜上的蛋白质,用来分析样品中蛋白质的种类及分子质量,Western印迹法步骤,先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，,再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，,然后加抗体形成抗原抗体复合物，,利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上,斑点印迹杂交（dot blotting）狭线印迹杂交（slot blotting）,更适于核酸样品的定量检测,原理与Southern杂交相同,在实验过程中，使用特殊设计的加样装置，使众多的待检测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵,斑点及狭缝印迹杂交的特点,1、斑点印迹为圆形,2、狭缝印迹为线状,3、鉴别DNA、RNA,4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品,5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,原位杂交（,in situ,hybridization）,生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用,1975年 Grunstein和Hongess 发展起来的,原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义,原位杂交定义,：,将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交,根据检测物分,细胞内原位杂交,和,组织切片内原位杂交,根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交,保持组织细胞的形态,对核酸无抽提，修饰与降解作用,不改变核酸在组织细胞内的定位,不阻碍核酸与探针的杂交过程,对杂交信号无遮蔽作用,理化性质稳定,2、杂交过程：,（1）组织或细胞的固定,理想固定液应具备：,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如,Triton x-100,和,SDS,）,和蛋白酶,K,去除核酸表面的蛋白质,组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体,控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻,片上脱落,（3）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针,探针的长度一般为,50,300bp,有时达,1.5kb,放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定,检测结果分辨率高，但信号检测时间长,非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易,于观察,（4）杂交,杂交液体积小：,10,20l,cDNA,和,RNA,探针杂交温度约为,50,杂交时间,:DNA,探针杂交为,2,4h.RNA,探针杂交过夜,杂交前一般将组织切片置,95 5,15,分钟使,DNA,变性,冲洗温度一般 不超过,50,（5）杂交结果检测,所用探针为核素标记,放射自显影检测,所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测,液相杂交,指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程,（一）RNA酶保护分析法,1、RNA酶保护分析法原理,RNaseA 和 RNaseT1,专一水解杂交体系中的单链RNA,，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法,2、杂交过程,制备待测,RNA,RNA,探针的制备与标记,：体外转录法制备和标,记,RNA,探针,杂交,：待测,RNA,与,RNA,探针在液相中杂交,RNaseA,和,RNaseTI,除去单链,RNA,电泳,分离,RNA,放射自显性检测杂交结果,（二）核酸酶S1保护分析法,1、原理,核酸酶S1在一定条件下,专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA,，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法,2、杂交过程,制备待测,RNA,：总,RNA,或,mRNA,均可,单链,DNA,探针的制备与标记,杂交,：单链,DNA,探针与待测,RNA,在液相中杂交,核酸酶,S1,除去单链,DNA,和单链,RNA,电泳,分离,DNA/RNA,杂交体分子,放射自显影检测杂交结果,第三节 核酸杂交的探针,化学及生物学意义上的探针(probe),指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子,抗体-抗原,、,生物素-抗生物素蛋白,、,生长因子-受体,的相互作用,每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究,同源或部分同源,基因组DNA探针,总cDNA探针 和 特异cDNA探针,(诊断试剂),RNA探针,人工合成寡核苷酸探针,(检测点突变和小段碱基的缺失或插入),一、常用探针类型：,1、按来源及性质划分,2、按标记物划分,放射性标记探针,非放射性标记探针,二、标记物,理想标记物应具备的特性：,高度灵敏性,不影响碱基配对的特异性,不影响探针分子的主要理化性质,对酶促反应活性无影响或影响不大,检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,1、放射性标记探针,用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍,优点：灵敏度高，可以检测到Pg级；,缺点：辐射危害（易造成放射性污染）,同位素的半衰期限制,32,P 高放射性 半衰期14.3 d,35,S 放射性较弱 半衰期87.1 d,3,H 放射性弱 半衰期12.35 y,2、非放射性标记物,光密度或电子密度标记物：,金、银、Hg,半抗原,：生物素（Biotin）、地高辛（digoxigenin）,配体,：生物素是亲和素的配体,荧光素,：异硫氰酸荧光素（,FITC,）、罗丹明（,TRITC,）,化学发光探针,：标记物与某种底物反应发光，,如：生物素酰化的,碱性磷酸酶（AKP）,可使发光底物发光,辣根过氧化物酶（HRP）,Biotin,（生物素）,Avidin,抗生物素蛋白,生物素,是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在,亲和素,或,抗生物素蛋白,上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测,地高辛,是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。,地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛,三、标记方法,体内标记法：,将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如,3,H-胸苷可掺入到DNA中，,3,H-尿苷可掺入到RNA中,体外标记法：,化学标记法,：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上,酶促标记法,：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上,酶促标记法,切口平移法（nick translation),1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口,2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5,3核酸外切酶活性在切口处将旧链从,5,末端逐步切除,3、在DNA聚合酶I的,5,3聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,切口平移法,(nick translation labeling),5,5,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,3,DNA酶I,DNA聚合酶I+标记的dNTP,5,3,变性,探针平均长度600bp,随机引物法,原理:,随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5,3方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,随机引物法,(random primed DNA labeling),5,3,5,3,5,3,5,3,随机6-12bp单核苷酸引物,变性,一般探针长度在400-600bp之间,随机引物法的优点：,1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记,2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题,3、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以上,4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,末端标记法,(terminal labeling),3末端,5末端,PCR标记法,光敏标记法,生物素、地高辛等,化学衍生结合标记法,转氨标记法等,光敏基团与生物素结合,光生物素（乙酸盐）、补骨脂素生物素和生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）,光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也可达到pg水平，可用于外源基因的检测,四、探针的纯化,1、乙醇沉淀法：,无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质,2、凝胶过滤柱层析法：,利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50,3、微柱离心法：,其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,杂交信号的检测,当,探针是放射性标记,时，杂交信号的检测通过放射自显影进行,非放射性标记的探针,，则需将非放射性标记物与检测系统偶联，再经检测系统的显色反应来检测杂交信号,非放射性核素探针的检测,1、偶联反应：半抗原通过抗原抗体反应与显色体系偶联,配体亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-comples,ABC）,2、显色反应：通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测,A、酶学检测,：是最常用的方法，通过酶促反应使底物形成有色产物。最常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP），也有使用酸性磷酸酶、和-半乳糖苷酶,A：酶学检测,B、荧光检测,：常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（TRITC），可被紫外线激发发出荧光而被检测到。主要用于原位杂交。,C、化学发光法,：是指在化学反应过程中伴随的发光反应。目前常用的是辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（luminol）伴随的发光反应。适合于Sourthern、Northern及斑点杂交,D、电子密度标记,：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下检测，适合于细胞原位杂交,核酸分子杂交实验因素的优化,探针的选择、标记方法、浓度,杂交率,杂交最适温度、反应时间,杂交促进剂,