绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中 的应用,生物发光现象,在无脊椎动物中很普遍。它是生物能量的一种转换方式 1,2。在水母(Jellyfish)中,当能量从 Ca+活化的水母蛋白(A equo rin)转移到绿色荧光蛋白(Green F luo rescen t P ro tein,简称GFP)上以后，它即发出绿色荧光。活体GFP与纯化的 GFP 具有相同光谱特性,即吸收蓝光,放射绿光。可以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分光光度计进行活体检测 。,由于GFP 稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性,因此它是一种独特的 报告蛋白(R epo rter p ro tein),可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域,。90年代后,有关GFP 及其利用的研究进展较快，已引起分子生物学家极大的兴趣与关注。,一GFP 的结构、特性与功能,1GFP 的结构,P rasher DC 首 先 克 隆 了 水 母 Jellyfish(,A equorea v ictoria GFP)的cDNA 6,GFP编码的238个氨基酸的多肽单体，推导分子量Mr=26888，与先前用变性电泳测得的天然 GFP 分子量（30 KD a）接近。根据DNA序列推导的氨基酸序列与大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP 分子才会产生生物荧光,但与荧光的产生直接有关的是GFP 分子中一小段被称为色基(Ch rom opho re)的部位（图2。在GFP的初级氨基酸序列上,第6567个氨基酸(SerTyrGly）,形成环状六肽三体,以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。色基形成的机理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的条件下,酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸,并环化形成六肽,这可能是形成色基的必然过程。,Sh im om u ra 最先推导了水母GFP色基结构，后来Ward等进行了进一步验证与修改。GFP的cDNA克隆序列分析表明，在2.6kb范围内至少分布有3个启动子，组成色基的SerTyrGly三体就位于第二个内含子3端,2GFP 的光谱特性,GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外)，并有一个峰值为470nm的副峰（蓝光）；发射光谱最大峰值为509nm(绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450490 nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测。Chroma技术公司(Chroma Technology Corp.Brattlebore,VT 05301,USA)已研制出一系列适合于GFP观察的滤光片组合。利用重组突变10,11,12和数字联想分光显微镜(Digital ImagingSpectroscopy)技术13,14,15可以诱发GFP色基突变,改变GFP光谱特性。Heim R等16,17获得了野生型GFP的一系列随机突变,其激发波长和发射波长都发生了变化(表1)。如获得的蓝色荧光突变,就是原GFP分子中第66个氨基酸由酪氨酸突变成的组氨酸,但荧光信号减弱了近50%。Delagrave S获得的红色漂移(Red-shifed)突变,与野生型GFP相比,其激发波长向红色方向漂移了近100 nm18。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析诊断等研究。,3 GFP的稳定性,GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强19。特别在450490 nm蓝光波长下更稳定,但在340390 nm或395440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2%巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1%H2O2,或硫氢基试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏20。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP荧光,但其最大吸收峰值会改变21。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体,使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶22。在离体状态下,GFP蛋白对热(70)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase除外)有较强抗性23。GFP荧光在pH值为712时稳定,在pH值为5.57.0时开始受影响24。在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复25,但可能需要某些硫醇类化合物的作用26。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现510g/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定27。此外,尽管GFP的消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。,二GFP 在分子生物学研究中的应用,2.1GFP 作为报告基因用于转基因研究,自Prasher DC从水母(A.victoria)中克隆了GFP的cDNA后,GFP能在原核和真核细胞中表达的表达载体相继被构建成功。Chalfie M构建了GFP大肠杆菌表达载体,GFP基因在T7启动子控制下很容易在大肠杆菌中高效表达。从转染的大肠杆菌中分离的GFP蛋白与水母的天然GFP离体光谱特性无差异。利用维管蛋白(-tubulin)基因mec-7启动子构建表达载体,转染线虫(Caenorhabditiselegans),在幼虫的4种胚性起源触觉受体神经元细胞中,观察到很强、很稳定的GFP荧光,包括部分2龄幼虫、所有4龄幼虫和绝大多数幼小成虫。据报道,GFP基因在酵母(Saccharomyces cerevisiae)、果蝇(Drosophila melanogaster)以及多种哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞系、人体胚性肾细胞系、猿猴Cos-1细胞系以及鼠NIH3T3细胞系等)中表达,都相继成功20,29,30,31,32。GFP在高等植物中的利用较晚,表达成功的例子还不多。Sheen J等报道,通过电击法(Electroporation)转染玉米叶肉原生质体,有50%原生质,体观察到GFP荧光,集中在细胞质或核周围部。紫外光下液泡显蓝色荧光,蓝光下叶绿体显红色荧光,出现黄色荧光是叶绿体红色荧光与GFP绿色荧光的重叠效果。HuW也报道,用电击法和PEG法同时转化玉米和拟南芥菜(Arabidopsis)原生质体,GFP在玉米原生质体中表达,但PEG介导比电击法转化效率高,而拟南芥菜原生质体中未观察到GFP表达33。不过Sheen J等利用基因枪(Microprojectile bombardment)轰击拟南芥菜完整叶片和根组织,观察到活体GFP荧光。Niedz RP等用电击法转化甜橙(Citrus sinensis)原生质体,450490 nm蓝光下观察到20%60%原生质体发生较强绿色荧光34。此外,也有GFP在菸草、水稻中表达的报道。GFP在多种原核和真核生物细胞中表达,表明GFP色基形成的翻译后修饰过程并非需要原有水母(A.victoria)细胞中任何其它成份或共因子。亦表明GFP作为报告基因,其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类型的限制,具有广泛的利用前景。,2.2 GFP作为报告蛋白用于基因表达的调控效果研究,Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter reporter vector)即没有启动子的GFP质粒,专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率,以及某些增强子对GFP表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK基因5端的非翻译片段(5VTR)与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接,GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动子)提高近15倍,因为5VTR片段中含转录增强子。用拟南芥菜热体克(Heat-shock)基因启动子构建GFP表达载体,用以转化玉米原生质体。发现42热激处理中50%原生质体表达GFP荧光;37处理的荧光较弱;而常温下培养,则完全观察不到原生质体中的GFP荧光。在高等植物遗传转化的基因表达调控研究中,已有很多报告蛋白被应用,包括Lac Z(-galactosidase)35、CAT(Chloramphenicolacethytransferase)36、Luc(荧光虫Luciferase)37,38和GUS(-glucuronidase)39等。但这些报告蛋白都是酶,其表达产物的检测都需要进行细胞固定、组织切片或蛋白提取等破坏性处理,很难用于活体观察和检测。GFP作为一种活体报告蛋白40,用于研究基因表达的调控,明显具有其它报告蛋白不可替代的优点,2.3 GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用,异质蛋白可以和GFP的N-端或C-端连接组成融合蛋白。GFP融合蛋白既保留了异质蛋白的固有特性,也保留了GFP的正常活性。因此,GFP融合蛋白,实际上可作为一种“荧光标签”用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移、相互作用等内容。Clontech公司构建了6种GFP融合蛋白载体。KaimSR利用GFP融合蛋白载体研究细菌致病性,即用GFP融合蛋白载体转化沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium),再侵染人的HEP-2细胞,并用若丹明(rhodamine-phalloidin)染色,在荧光显微镜下观察。若细菌只侵染到细胞表面,只在细胞表面呈现绿色荧光(GFP表达信号);若细菌已侵入细胞内部,则培养细胞呈现黄色荧光,这是GFP表达的绿色荧55薛启汉:绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用光与细胞若丹明染色的红色荧光的重叠效果。因此,利用GFP融合蛋白为“荧光标签”,可以直接活体观察到细菌蛋白和报告蛋白在细胞中的确切位置,以表明细菌在活体细胞中的侵染状况。同样原理,Youvan构建了菸草花叶病毒和GFP的融合蛋白载体TWV-GFP。Banlcombe DC构建了马铃薯X病毒和GFP的融合蛋白载体PVX-GFP41接种菸草(N.clevelandii)12天后,在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位。再用首次感染的菸草汁液接种另一种菸草(N.benthamiana),观察到已放大的第二次系统感染的绿色荧光斑点。叶片提取液蛋白电泳凝胶在紫外光下也能见到GFP荧光信号,从感染叶片中回收的病毒经鉴定,确认为PVX-GFP。构建载体时,直接用GFP基因替代病毒外壳蛋白基因,接种后观察到GFP绿色荧光只局限于接种的细胞部位,不扩散。证实了早先的论断,即PVX外壳蛋白对于病毒在寄主细胞内的增殖,以及在细胞间的移动、扩展是不可缺少的条件42,43,44,45,46,47。显然,GFP融合蛋白作为一种报告标记,可以为病毒学研究,或以病毒载体为途径研究外源基因在转基因生物细胞中的表达及蛋白质定位,提供理想的工具48,49,50。与传统的荧光抗体相比,GFP不仅灵敏度高,不需要反应底物,还可以消除因抗体与非靶位点结合带来的背景荧光的干扰。,2.4 GFP报告蛋白用于细胞活体分离与纯化,利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(FACS),可以分离与纯化特殊类型细胞,对分析cDNA文库、研究基因的细胞发育或组织专一性表达十分重要51,52。利用GFP融合蛋白为细胞表面活体荧光标记,通过筛选已经获得GFP表达的大肠杆菌、人体肾细胞和猿猴COS-1细胞特殊类型。Sheen J等在GFP转染玉米原生质体的流体参数分析中发现,转染1518小时后,对照中只有一类细胞丛,表现较强红色荧光和微弱的绿色荧光,并且细胞间荧光强度相当一致,没有明显差异。而GFP转染的原生质体中出现两类细胞丛,第一类与对照相似,呈现红色荧光,约占细胞总数66.3%;第二类细胞丛呈现绿色荧光,荧光强度是对照的74倍。因此,用流式细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(Epics Elite,Conlter Electronics,Miami FL,USA)很容易将两类细胞分离开来。原生质体可以来源于不同类型的组织细胞原生质体表达的GFP信息,即可代表某种组织的信息。采用发育专一性启动子构建GFP表达载体,可以将这些具有基因表达特异性的细胞类型分离出来。利用不同表达文库转染原生质体,通过流体参数分析和细胞分类,可以揭示在信号传导途径中所包含的许多反方活化因子(trans-activating fectors)。GFP在生物学和分子生物学研究中的利用还不仅仅局限于上述几个方面。随着研究的深入开展,其广泛利用的潜力将不断表现出来。,3 GFP应用中的问题及注意事项,野生型GFP的cDNA(gfp 10)中GFP编码序列的框架结构会抑制GFP表达。在构建GFP表达载体时可以将其修饰成Kozak consensus,以提高GFP在真核细胞中的翻译效率53。长时间的高强度激发光可能使GFP产生自由基(Free radicles),对细胞有毒害。可选用450490 nm长波光激发,将其减少到最低程度。GFP表达荧光强度可能会产生变异和不稳定,影响因素之一可能是缺乏分子氧,致使GFP色基形成缓慢。此外,细胞的培养环境往往会影响GFP表达效率,如大肠肝菌在24或30下培养,GFP表达效率会明显高于37培养的菌落。有些研究者在自己的GFP转化体系中未能成功地观测到GFP荧光信号,可能有多种原因,包括表达载体构建不合理、使用的荧光显微镜滤光片组合不合适、GFP在转染细胞中表达量过低,以及样品或塑料容器的自然荧光干扰或激发光受阻等。目前科学家正在致力于构建表达水平更高,特别是适合于高等植物遗传转化的GFP载体。,