SZDB∕Z 267-2017 肉食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 67.120 X 22 SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 SZDB/Z 2672017 肉食品中鸡源性成分实时荧光 PCR 检测方法 Real-time PCR for detection of chicken-derived ingredients in food 2017 - 09 - 12 发布 2017 - 10 - 01 实施深圳市市场监督管理局 发 布 SZDB/Z 2672017 I 目 次 目次 . I前言 . II1 范围 . 12 规范性引用文件 . 13 术语和定义 . 14 缩略语 . 15 原理 . 16 设备 . 27 主要器械和设备 . 28 检验步骤 . 29 质量控制 . 310 结果判定与表述 . 3附 录 A . 4 SZDB/Z 2672017 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本文件的附录A为资料性附录。 本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。 本文件由中华人民共和国深圳出入境检验检疫局归口。 本文件主要起草单位： 深圳市检验检疫科学研究、 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心。 本文件主要起草人：张彩虹、阮周曦、叶奕优、花群义、谢丽琪、林燕奎、林彦星、曹琛福、黄超华、孙洁、杨俊兴、吕建强、曾少灵。 SZDB/Z 2672017 1 肉食品中鸡源性成分实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了肉食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于肉食品中鸡源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法场地通用规范 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 COX3：细胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase subunit ） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-Carboxyl-X-Rhodamine） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris (hydroxymethyl) aminomethane EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid） 5 原理 SZDB/Z 2672017 2 样品经研磨混匀后，提取 DNA，以 DNA 为模板，采用鸡线粒体 COX3 基因特异性检测引物和探针进行实时荧光 PCR 扩增，根据 Ct 值，判断样品中是否存在鸡源性成分。 6 设备 6.1 试剂 裂解液（参见附录 A），三氯甲烷，异丙醇，75%乙醇，双蒸水。 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水为 GB/T 6682 规定的二级水。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器盛装。 6.2 引物及探针序列 a) 上游引物 F：5-TCTCACTTACACTACTTGCCACATCTT-3 a) 下游引物 R：5-CGTGTGTGTCCTGTTTGGACTAG-3 b) 探针序列 P：5-FAM- CACTGCAACCTACAGCCTCCGCATAACBHQ1 -3 7 主要器械和设备 高速离心机（最大离心力达 12 000g 以上），微量移液器（10 L, 100 L, 1000 L），实时荧光 PCR 仪，恒温水浴锅，天平（感量 0.001 g 和 0.1 g），涡旋振荡器，pH 计。 8 检验步骤 8.1 样品制备 称取待检样品200 mg，研磨混匀待用。 8.2 核酸提取 称取上述混匀样品50 mg于1.5 mL离心管中，加入600 L800 L裂解液，65 作用30 min，期间不时振荡混匀；12 000 r/min离心5 min；转移上清液于洁净离心管中，加400 L三氯甲烷/异戊醇（24:1），混匀；12 000 r/min离心5 min，取上清液；加0.8倍体积预冷的异丙醇，沉淀；12 000 r/min离心5 min， 弃上清液； 75%乙醇洗涤一次， 晾干； 加入50 L 双蒸水溶解沉淀， 制成DNA溶液， 保存-20 待用。也可用等效DNA提取试剂盒提取样品DNA。 8.3 实时荧光 PCR 扩增 反应体系：体积为20 L，包括2Probe qPCR MIX 10 L（内含DNA聚合酶、dNTP等）、50ROX Reference dye 0.04 L、正向引物(10 mol/L) 1 L、反向引物(10 mol/L) 1 L、探针(10 mol/L)0.5 L、模板DNA 0.8 L、补足双蒸水至总体积20 L。也可选用其它商品化实时荧光PCR反应预混液。 反应条件：95 预变性20 s；95 变性3 s，60 退火30 s，60 收集荧光，40个循环。 也可选用其它商品化实时荧光PCR反应预混液，并参照其说明书进行适当调整。 8.4 实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照，样品及对照均设两个重复，Ct值取两个重复的平均值作为最终结果。采用已知含有鸡源性成分的鸡肉提取的DNA作为阳性对照。采用已知不含鸡源性SZDB/Z 2672017 3 成分的其它动物组织（如羊肉、鸭肉）提取的DNA作为阴性对照。采用与模板等体积的双蒸水作为空白对照。 9 质量控制 9.1 质控要求 同时满足以下条件时，实验有效： a) 空白对照：无荧光对数增长，无 Ct 值。 b) 阴性对照：无荧光对数增长，无 Ct 值。 c) 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值30.0。 9.2 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 中的规定执行。 10 结果判定与表述 10.1 结果判定 在符合 9.1 条的情况下，被检样品进行检测时： a) 如 Ct 值35.0，且荧光通道出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性。 b) 如无 Ct 值，则判定为被检样品阴性。 c) 如 35.0Ct 值40.0，则重复一次。如再次扩增后 Ct 值40.0，则判定为被检样品阳性；如再次扩增后无 Ct 值，则判定被检样品阴性。 10.2 结果表述 结果为阳性者，表述为“检出鸡源性成分”；结果为阴性者，表述为“未检出鸡源性成分”。 SZDB/Z 2672017 4 附 录 A (规范性附录) 裂解液配制方法 1% CTAB； 0.05 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）； 0.7 mol/L NaCl； 0.01 mol/L EDTA (pH 8.0)。