儿童变应性鼻炎Th17_Treg表达与中医证型及病情的相关性研究.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究儿童变应性鼻炎Th17/Treg表达与中医证型及病情的相关性研究谢柳，李淑芳，王翔，符国庆，王海川（海南省中医院 海口 570203）摘要：目的探讨不同中医证型变应性鼻炎（AR）患儿Th17/Treg及其细胞因子的表达特点，并分析Th17/Treg细胞失衡与儿童AR症状评分的相关性。方法130例AR患儿根据中医证型分为肺气虚寒组（50例）、脾气虚弱组（32例）、肾阳不足组（21例）和肺经伏热组（27例），30例健康儿童为对照组。检测各组外周血Th17、Treg细胞水平和IL-17、TNF-、IL-10、TGF-表达水平。并分析不同中医证型患儿Th17/Treg比值与AR症状评分的相关性。结果Th17细胞水平和IL-17、TNF-水平在肺经伏热证患儿中表达最高，肺气虚寒证和脾气虚弱证次之，肾阳不足证最低。肺气虚寒证和脾气虚弱证Treg细胞水平和IL-10、TGF-水平低于肺经伏热证和肾阳不足证。肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿Th17/Treg比值最高，肺经伏热证次之，肾阳不足证最低。各中医证型患儿Th17/Treg比值均与AR症状评分呈正相关（P0.05）。本研究 收稿日期：2022-06-19 修回日期：2022-10-15 海南省卫生计生委普通科研课题（19A200038）：梅花针拔罐法结合玉屏风颗粒治疗变应性鼻炎的临床研究；负责人：李淑芳。通讯作者：谢柳，主治医师，主要研究方向：中医药治疗变应性鼻炎的基础与临床研究。1481 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 得到海南省中医院伦理委员会批准，所有入选儿童及其家长均对本研究知情同意。1.2诊断标准1.2.1西医诊断标准根据 儿童变应性鼻炎诊断和治疗指南（2010年，重庆）5制定儿童变应性鼻炎诊断标准：出现鼻痒、喷嚏、鼻塞、清水样涕等症状中的2项或2项以上，持续或累积时间每天1 h，可伴有眼痒、流泪、结膜充血等眼部症状；鼻腔见水样分泌物，鼻黏膜灰白、苍白或浅蓝色，鼻甲肿大；至少一种变应原点刺试验阳性和/或血清特异性IgE阳性。1.2.2中医辨证标准参照 鼻鼽中医诊疗指南4和 中医儿科临床诊疗指南 小儿鼻鼽6制定儿童AR辨证分型标准：肺气虚寒证，主症：鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕、鼻黏膜淡红或苍白、鼻甲肿大；次症：畏风怕冷、气短懒言、语声低怯、自汗、或见咳嗽痰稀、面色白、舌淡红、苔薄白、脉浮或细弱。脾气虚弱证，主症：喷嚏、鼻塞、鼻痒、流清涕、鼻黏膜淡白、鼻甲肿胀；次症：食少、便溏、腹胀、倦怠乏力、头身困重、面色萎黄、舌淡胖、边有齿痕、苔白、脉滑或细弱。肾阳不足证，主症：鼻痒、喷嚏、鼻塞、流清涕、鼻黏膜苍白、鼻道水样分泌物；次症：畏寒肢冷、腰膝酸软、面色无华、神疲倦怠、小便清长、舌淡、苔白、脉沉细。肺经伏热证，主症：鼻痒、鼻塞、喷嚏频发、流清涕或粘稠涕、鼻黏膜偏红、鼻甲肿胀；次症：口干烦热、咽痒可伴有咳嗽、鼻腔干燥、面色红赤、小便短赤、舌红、苔黄、脉数。以上4种证型辨证要求均为具备3项主症加3项以上次症。1.3研究组纳入及排除标准纳入标准：符合上述西医诊断标准，且中医辨证明确；年龄6-12岁；自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：确诊为急性鼻窦炎、血管运动性鼻炎、嗜酸性粒细胞增多症者；合并哮喘、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、肾小球肾炎、过敏性紫癜等自身免疫、变应性疾病者；既往3个月内接受过糖皮质激素或免疫抑制剂治疗者；合并肝、肾功能不全、免疫缺陷或精神障碍者。1.4对照组纳入标准年龄6-12岁；血常规、肝肾功等检查结果在正常范围；1 个月内无急性感染；既往无 AR、哮喘、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、肾小球肾炎、过敏性紫癜等自身免疫、变应性疾病；自愿参与本研究，并签署知情同意书。1.5检测指标1.5.1外周血Th17细胞检测入选研究对象均于晨起空腹采集静脉血，采用人淋巴细胞分离液分离外周血单一核细胞（PBMCs），应用 RPMI1640 培养基调整 PBMCs 浓度为 1107mL-1，取PBMCs悬液100 L接种于培养液，加入PMA、离子霉素和莫能菌素，37、5%CO2细胞培养箱培养6 h，将培养出的细胞等分为两份，分别标记为测定管和对照管，每管均加入20 L PE-CD4抗体，室温下避光孵育20 min，洗涤后加固定液，室温避光反应20 min后加入破膜剂进行细胞打孔，1500 rmin-1离心5 min，弃上清后于测定管加 10 L IL-17-PE，对照管加 10 L IgG1-PE，室温避光孵育15 min进行细胞因子染色，应用流式细胞仪检测Th17细胞占CD4+T细胞的比例。1.5.2外周血Treg细胞检测另取 PBMCs 悬液 100 L，加入 FITC-CD4 单抗20 L和PE-CD25单抗5 L，室温避光孵育20 min，缓冲液洗涤细胞，离心弃上清，涡旋分散细胞后加入1 mL固定/破膜工作液，室温避光孵育30 min，洗涤细胞并离心弃上清，加 100 L permeabilization buffer 重悬细胞后加入 200 L 二抗 Foxp3，室温避光孵育20 min，再次洗涤细胞并弃上清，用适量流式染色液重悬细胞后应用流式细胞仪检测Treg细胞占CD4+T细胞的比例。1.5.3Th17、Treg细胞因子检测所有研究对象均于晨起空腹采集静脉血 5 mL，3000 rmin-1离心10 min，收集血清样本，应用全自动化学发光分析仪及配套试剂盒，采用酶联免疫吸附法检测Th17、Treg细胞的主要细胞因子白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-（TGF-）水平。1.5.4AR患儿病情严重程度评估应用AR症状评分对AR患儿的病情严重程度进行评估，参照 变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015年，天津）7对AR患儿入组时喷嚏、流涕、鼻塞、鼻痒4个症状进行评分，评分标准见表1，总分0-12分，症状评分越高代表患儿病情越严重。1.6统计学方法采用SPSS 22.0进行数据统计分析，计数资料以百1482 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究分比表示，组间比较采用2检验，计量资料以均值标准差（x s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用 LSD 多重比较，Th17/Treg 比值与AR症状评分相关性采用Pearson相关分析，以P0.05），见表2。表2儿童AR患者中医证型分布情况比较x s，例（%）组别肺气虚寒证脾气虚弱证肾阳不足证肺经伏热证F或2值P值n50322127年龄（岁）9.101.699.061.779.411.669.031.730.4590.711性别（男）29（58.00%）14（43.75%）13（61.90%）18（66.67%）3.5460.315病程（年）1.400.471.350.351.250.511.200.531.1080.348表3同中医证型患儿Th17、Treg细胞水平及Th17/Treg比值比较（x s）组别肺气虚寒组脾气虚弱组肾阳不足组肺经伏热组对照组F值P值n5032212730Th17（%）2.811.01*2.640.87*1.930.56*3.551.13*1.450.2225.2950.000Treg（%）2.540.85*2.480.83*3.521.06*3.871.25*4.640.6733.4190.000Th17/Treg1.270.32*1.230.31*0.640.29*1.050.28*0.320.6673.9700.000注：与对照组比较，*P0.05；与肺经伏热组比较，P0.05；与肾阳不足组比较，P0.05。表1鼻部症状分级评分标准记分0分1分2分3分喷嚏（连续个数）33-56-10 10流涕（次/天）几乎无 45-9 10鼻塞几乎无有意吸气时可感觉间断出现近乎全天用口呼吸鼻痒几乎无间断出现蚁行感，可忍受蚁行感，难以忍受表4同中医证型患儿血清Th17、Treg细胞因子比较（x s，pgmL-1）组别肺气虚寒组脾气虚弱组肾阳不足组肺经伏热组对照组F值P值n5032212730IL-1744.6711.18*45.0610.12*37.999.82*54.1612.52*29.109.0921.7440.000TNF-13.253.02*13.903.20*11.632.48*16.284.34*9.742.2817.1470.000IL-1056.569.53*61.148.85*67.8811.95*73.2115.56*82.5216.8223.6890.000TGF-20.799.54*18.326.73*27.318.69*27.9411.27*35.6512.0315.7890.000注：与对照组比较，*P0.05；与肺经伏热组比较，P0.05；与肾阳不足组比较，P0.05。1483 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 2.2不同中医证型患儿Th17、Treg细胞水平和Th17/Treg比值比较各证型患儿Th17细胞水平和Th17/Treg比值均高于对照组，Treg细胞水平均低于对照组（P0.05），表明不同中医证型 AR 患儿均存在不同程度的 Th17/Treg细胞免疫失衡。各证型间比较，肺经伏热组Th17细胞水平高于其他 3 种证型，肺气虚寒组和脾气虚弱组Th17细胞水平高于肾阳不足组（P0.05），表明肺经伏热证AR患儿机体免疫炎症反应最严重。肺气虚寒组和脾气虚弱组Treg细胞水平低于肺经伏热组和肾阳不足组（P0.05），表明肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿的免疫抑制功能较差。肺气虚寒组和脾气虚弱组Th17/Treg比值高于肺经伏热组和肾阳不足组，肺经伏热组Th17/Treg比值高于肾阳不足组（P0.05），表明肺气虚寒和脾气虚弱证 AR患儿的 Th17/Treg细胞免疫失衡最严重，见表32.3不同中医证型患儿血清Th17、Treg细胞因子比较各证型患儿血清IL-17、TNF-水平均高于对照组，血清 IL-10、TGF-水平均低于对照组（P0.05），表明不同中医证型AR患儿均存在不同程度的免疫失衡。各证型间比较，肺经伏热组血清IL-17、TNF-水平高于其他3种证型，肺气虚寒组和脾气虚弱组血清IL-17、TNF-水平高于肾阳不足组（P0.05），表明肺经伏热证AR患儿机体免疫炎症反应最严重。肺气虚寒组和脾气虚弱组血清IL-10、TGF-水平低于肺经伏热组和肾阳不足组（P0.05），表明肺气虚寒证和脾气虚弱证AR患儿的免疫抑制功能较肺经伏热证和肾阳不足证患儿差，见表4。2.4不同中医证型AR患儿Th17/Treg比值与病情的相关性分析经 Pearson 相关分析显示，肺气虚寒证（r=0.474，P=0.001）、脾气虚弱证（r=0.444，P=0.011）、肾阳不足Th17/Treg比值1.251.000.750.500.25症状评分（分）9.08.07.06.05.04.0r=0.661 P=0.001图3肾阳不足证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性Th17/Treg比值1.601.401.201.000.800.60症状评分（分）11.010.09.08.07.06.05.0r=0.529 P=0.001图4肺经伏热证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性Th17/Treg比值2.001.751.501.251.000.75症状评分（分）11.010.09.08.07.06.0r=0.474 P=0.001图1肺气虚寒证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性Th7/Treg比值1.751.501.251.000.75症状评分（分）12.011.010.09.08.07.06.0r=0.444 P=0.011图2脾气虚弱证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性1484 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究证（r=0.661，P=0.001）、肺经伏热证（r=0.529，P=0.001）4 个中医证型 AR 患儿的症状评分均随外周血 Th17/Treg比值的升高而增高，Th17/Treg比值与AR症状评分呈正相关，见图1-4。3 讨论 传统中医认为鼻鼽的病机为脏腑功能虚弱基础上感受风寒而所致，是正虚与邪侵共同作用的结果，正虚集中表现为肺、脾、肾三脏气阳虚弱。虚寒之体感受外邪，则邪易从寒化，留滞鼻腔而为病8-9。因此目前将变应性鼻炎归纳为肺气虚寒证、脾气虚弱证、肾阳不足证、肺经伏热证4个基本证型。本研究显示儿童AR中以肺气虚寒证为主，肾阳不足证所占比例最低。由于传统中医辨证易受医师主观因素和临床经验的限制，且AR发生于深在腔窍器官，如不借助现代医学检测技术，很难对局部表现有准确认知。因此现代中医倡导将中医辨证与现代技术手段相结合，以提高中医辨证的准确率和客观性，而Th17/Treg细胞失衡与多种免疫性疾病中医证型间的相关性研究是近年来的研究热点。AR发病的免疫机制极其复杂，涉及多种细胞因子、炎症细胞及信号传导通路，其中 Th17/Treg 免疫失衡便是AR发生、发展的重要机制之一。Th17细胞是 一 种 新 型 CD4+T 细 胞 亚 群，主 要 分 泌 IL-17 和TNF-，具有强大的促炎作用，可以聚集、活化嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，并能激活 Th2细胞，使血清IgE 特异性升高，进而介导 AR 局部炎症的发生与发展10-12。近年来研究显示 AR 患者 Th17 细胞和血清IL-17、TNF-表达水平异常升高13，本研究也显示AR 患儿 Th17 细胞水平及其细胞因子 IL-17、TNF-水平均高于对照组，且在不同中医证型AR患儿间也存在显著表达差异，其中肺经伏热证患儿表达最高，其次为肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿，表明肺经伏热证 AR 患儿机体免疫炎症反应最严重。刘慧霞等14研究也显示肺经伏热证患者的血清总 IgE 水平最高，表明肺经伏热证患者机体处于免疫炎症反应的亢进状态。Treg细胞是近年来发现的不同于其他Th细胞的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-10和TGF-，在体内执行免疫抑制功能，减弱过度和错误免疫效应导致的组织损伤15-16。黄帝内经 记载“阳气者，卫外而为固也。”中医正气学说认为人体正气若亏虚，则机体抵御外邪的能力就减弱，风寒容易乘虚而入，从而引发疾病，因此中医正气学说与现代免疫学中的免疫耐受能力可能存在相关性。本研究显示各中医证型AR患儿Treg水平和血清IL-10、TGF-水平均低于对照组，在AR患儿中以肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿的表达水平最低，表明随着AR患儿机体正气亏虚，以Treg细胞为代表的抑制性免疫功能逐渐下降，尤其以肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿降低最明显。薛雪等17在成人过敏性紫癜肾炎患者中也发现气虚患者外周血Treg细胞水平最低，与本研究结果一致。Th17和Treg细胞的分化过程和功能相互拮抗，正常情况下Th17/Treg保持动态平衡，在维持机体免疫平衡中发挥着重要作用，谭年花等18研究认为Th17/Treg比值能更好的反映机体免疫失衡程度，本研究显示肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿Th17/Treg比值最高，表明这两种中医证型的 AR患儿 Th17/Treg免疫失衡最严重，临床工作中应予以重点关注。随着AR患儿机体免疫失衡的进展，其鼻腔局部炎症反应也随之不断加重，进而使鼻腔血管通透性及鼻黏膜水肿程.度恶化。符涛等19及 Van Nguyen 等20研究均证实 Th17/Treg 免疫失衡程度与 AR 患者的病情严重程度密切相关，Th17/Treg比值越高，AR患者鼻塞、鼻痒、喷嚏、流涕的症状就越严重。但不同中医证型AR患儿的病情是否也与Th17/Treg免疫失衡相关目前尚无定论。本研究结果显示4种中医证型AR患儿的症状评分均于Th17/Treg比值呈正相关，表明不论哪种中医证型的AR患儿，其病情严重程度均于 Th17/Treg 免疫失衡相关，Th17/Treg 细胞检测可为儿童 AR 的病情评估提供参考。综上所述，儿童AR各中医证型间Th17/Treg免疫失衡程度存在显著差异，儿童AR各中医证型可能处于不同的免疫状态中，Th17、Treg细胞及其细胞因子检测可为儿童AR的中医辨证论治及病情评估提供客观依据。但 Th17/Treg细胞平衡只是 AR中医辨证要素的一部分，AR辨证应包括患者机体的多种客观及微观指标，未来应将更多的细胞或细胞因子纳入到AR中医现代化研究中，为探索AR中医辨证论治的客观规律提供依据。1485 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 参考文献 21李淑芳,谭业农,王翔,等.热带地区儿童变应性鼻炎流行特征：基于海南省海口市的调查.环境与职业医学,2020,37(11):1095-1099.2彭慧慧,冷建杭,沈俊娅,等.Th17/Treg和Th1/Th2细胞失衡对变应性鼻炎发病机制的研究.中国卫生检验杂志,2020,30(18):2234-2237.3Oyamada H A A,Cafasso M O S D,Vollmer C M,et al.Major depressive disorder enhances Th2 and Th17 cytokines in patients suffering from allergic rhinitis and asthma.Int Arch Allergy Immunol,2021,182(12):1155-1168.4刘静,李蕾,石颖,等.鼻鼽中医诊疗指南 临床应用评价体会.中华中医药杂志,2016,31(7):2662-2665.5中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会鼻科组,中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组、小儿学组,中华儿科杂志编辑委员会.儿童变应性鼻炎诊断和治疗指南(2010年,重庆).中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2011,46(1):392-404.6汪受传,李辉,徐玲.中医儿科临床诊疗指南 小儿鼻鼽.中华中医药杂志,2016,31(4):1352-1355.7中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会鼻科组,中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年，天津).中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2016,51(1):6-24.8江雅宜,岳仁宋,周建龙.基于 黄帝内经“心部于表”探讨鼻鼽病机.中国中医基础医学杂志,2020,26(11):1593-1594.9李幼瑾,丁丽凤,芮晓清,等.儿童变应性鼻炎中医证候规律研究.浙江中医药大学学报,2018,42(7):532-535.10 Miao Q,Liu Y G,Xu W,et al.Comparison of Th17 cells mediated immunological response among asthmatic children with or without allergic rhinitis.Asian Pac J Allergy Immunol,2019,37(2):65-72.11 Salmani A,Mohammadi M,Farid Hosseini R,et al.A significant increase in expression of FOXP3 and IL-17 genes in patients with allergic rhinitis underwent accelerated rush immunotherapy.Iran J Basic Med Sci,2019,22(9):989-996.12 彭林峰,桂雄斌,王明刚,等.Treg/Th17在变应性鼻炎发病机制中作用的研究进展.广西医学,2021,43(7):868-871.13 刘婷,任秀敏,郝东阳,等.变应性鼻炎患者白细胞介素23和白细胞介素27对调节性T细胞/辅助性T细胞17细胞平衡的调控作用.中国耳鼻咽喉头颈外科,2018,25(6):315-319.14 刘慧霞,肖志贤,吴跃,等.变应性鼻炎(鼻鼽)中医辨证分型的研究进展.四川中医,2021,39(3):219-223.15 张丽霞,刘涛.Treg通过TICAM-1通路对变应性鼻炎发病机制的影响.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2018,32(22):1763-1766.16 Fan Y Q,Yang C C,Zhou J Y,et al.Regulatory effect of glutathione on treg/Th17 cell balance in allergic rhinitis patients through inhibiting intracellular autophagy.Immunopharmacol Immunotoxicol,2021,43(1):58-67.17 薛雪,柳强,王小琴,等.成人过敏性紫癜肾炎外周血Treg/Th17细胞轴表达与中医证型的相关性.世界科学技术-中医药现代化,2020,22(8):2907-2913.18 谭年花,陈斌,彭杰,等.乙肝相关性慢加急性肝衰竭“阳黄-阴阳黄-阴黄”不同证候分型患者Treg/Th17的表达.中国实验方剂学杂志,2020,26(2):33-38.19 符涛,张先喜.变应性鼻炎患者Th17/Treg细胞比例与病情严重程度的相关性分析.广西医科大学学报,2018,35(3):369-372.20 Van Nguyen T,Piao C H,Fan Y J,et al.Anti-allergic rhinitis activity of -lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling.Sci Rep,2020,10:12528.Correlation Analysis of Th17/Treg Expression and TCM Syndromes and Severity of Allergic Rhinitis in ChildrenXie Liu，Li Shufang，Wang Xiang，Fu Guoqing，Wang Haichuan(Hainan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Haikou 570203,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the expression characteristics of Th17,Treg and related cytokines in children with allergic rhinitis(AR)with different traditional Chinese medicine(TCM)syndromes,and the correlation between Th17/Treg imbalance and severity of allergic rhinitis in children was analyzed.MethodsA total of 130 children with AR were divided into deficiency cold of lung qi group(50 cases),spleen qi deficiency group(32 cases),kidney yang deficiency group(21 cases),hidden heat in lung group(27 cases)according to TCM syndromes,and 30 healthy children in the same period were selected as control group.The levels of Th17 and Treg cells in peripheral blood was detected by flow cytometry,and the expression levels of IL-17,TNF-,IL-10 and TGF-were detected by enzyme-linked 1486 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究immunosorbent assay.The correlation between Th17/Treg ratio and AR symptom score in different TCM syndromes was analyzed by pearson correlation.ResultsThe levels of Th17 and IL-17,TNF-of hidden heat in lung group were higher than the other three TCM syndrome groups,those of deficiency cold of lung qi group and spleen qi deficiency group were higher than those of kidney yang deficiency group.The levels of Treg and IL-10,TGF-of deficiency cold of lung qi group and spleen qi deficiency group were lower than those of kidney yang deficiency group and hidden heat in lung group.The Th17/Treg ratio of deficiency cold of lung qi group and spleen qi deficiency group was higher than that of kidney yang deficiency group and hidden heat in lung group.The Th17/Treg ratio of hidden heat in lung group was higher than that of kidney yang deficiency group.Th17/Treg ratio was positively correlated with AR symptom score(P0.05).Conclusions The expression of Th17/Treg cells and related cytokines is different among different TCM syndromes of children with AR,which can provide objective basis for TCM syndrome differentiation and treatment of children with AR.In addition,the imbalance degree of Th17/Treg is positively correlated with the severity of AR in children with different syndrome types.Keywords:Allergic rhinitis,TCM syndrome,T helper cells 17,Regulatory T cells,Correlation（责任编辑：刘玥辰）1487