微生物和健康.11.17.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,一、微生物生长繁殖的规律,微生物个体的生长繁殖（如：细菌）,微生物群体的生长繁殖（如：细菌）,细菌生长繁殖的规律,（一）细菌个体的生长繁殖,二分裂方式（,binary fission）,代时(,generation time)：,多数为20,30,min,细菌的主要繁殖方式,（二分裂方式）,染色体复制,细胞继续生长,分裂为两个细胞,（二）细菌群体的生长繁殖,生长曲线：,细菌接种到定量的,液体培养基,中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵坐标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,1迟缓期(,lag phase),a-b,2,对数期(,logarithmic phase),b-c,3,稳定期(,stationary phase),c-d,4衰亡期(,decline phase),d-e,细菌的生长曲（,growth curve,）,1迟缓期(,lag phase),a-b,细菌的生长曲线（,growth curve,）,1.,迟缓期,把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个,调整和适应,过程。,特点：,生长速率常数等于零,含量增加,代谢活力强,对不良条件抵抗能力降低,影响,其长短,因素,:,接种龄,接种量,培养基成分,缩短迟缓期的意义和方法,意义：,可以缩短生产周期，提高设备利用率,方法：,接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄,加大接种量,2,对数期(,logarithmic phase),b-c,细菌的生长曲线（,growth curve,）,2.,对数期,(,指数期,)(exponential phase),特点：,该期的细菌生产中多被用做种子和科学试验材料,活菌数和总菌数接近,酶系活跃，代谢旺盛,生长速率最大,细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致,影响因素,:,菌种,营养成分,营养物浓度,培养温度,3,稳定期(,stationary phase),c-d,细菌的生长曲线（,growth curve,）,3.,稳定期,(stationary phase),营养的消耗,营养物比例失调,有害代谢产物积累,pH,值等理化条件不适,出现原因,特点：,活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平,细菌代谢物积累达到最高峰,芽孢杆菌这时开始形成芽孢,这是生产收获时期,4衰亡期(,decline phase),d-e,细菌的生长曲线（,growth curve,）,4.,衰亡期,(decline phase/death phase),特点：,细菌死亡数大于增殖数,活菌数明显减少,群体衰落,细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型,细胞死亡,出现自溶现象,(1),生长量测量法,体积测量法（测菌丝浓度法）,称干重法,比浊法,菌丝长度测量法,测定含氮量,测定含碳量,DNA/RNA,法等,(2),微生物计数法,微生物生长的检测方法,微生物生长：,单位时间里微生物数量或生物量（,Biomass,）的变化。,血球计数板法,染色计数法,比例计数法 液体稀释法,平板菌落计数法,试剂纸法,膜过滤法,(3),生理指标法,平板菌落计数法,二,.,影响微生物生长的主要因素,影响微生物生长的外界因素很多，除,营养条件,外，,还有许多条件。其中最主要的,有水、温度、,pH,和氧气。,1.,营养物质：,营养物质不足，导致微生物生长停止，,或体内营养物质的再利用,2.,水：,微生物在生长过程中对培养基的水有一定,要求（,细菌,:0.91;,酵母菌,:0.88,；霉菌,:0.80,）,水活度,可利用水用水活度（,Q,w,）表示,Q,w,：在相同的温度和压力下，溶液中水的蒸气压和纯水的蒸气压的比即,a,n,=P,溶液,/P,纯水,，微生物生长所需的水活度，,0.63,0.99,之间，水中溶质越高水活度越低。,3.,温度,低温型,高温型,25-45 50-60 70-95,中温型,生长温度范围（）,最低 最适 最高,微生物类型,分布的主要场所,专性嗜冷,-12 5-15 15-20,兼性嗜冷,-5-0 10-20 25-30,室温,10-20 20-35 40-45,体温,35-40,两极地区,海水、冷藏食品,腐生菌,寄生菌,温泉、堆肥堆、,土壤表层等,嗜冷微生物（低温微生物）,酶系在低温下仍能起催化作用,细胞膜含较多的不饱合脂肪酸在低温下仍,具有通透性。,嗜冷机制：,低温对微生物的,影响,:,代谢降低,生长繁殖停滞,仍然存活,常在低温下对菌种和食品保藏。,嗜热微生物的嗜热机制,细胞内的酶具有强抗热性；,产生的多胺、热亚胺和高温精胺物质对蛋白质,等组织结构具有保护作用；,核酸也具有热稳定性的保护结构；,细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，,使膜具有稳定性。,4.pH,值,影响细胞膜透性与稳定性,影响物质溶解度,影响细胞表面电荷分布因此影响微生物生长、繁殖，发育。,各类微生物能够生长的,pH,值较宽，,但细胞内部,pH,值却接近中性。,微生物的活动也能改变环境中的,pH,值,影响细胞膜透性与稳定性,嗜酸性微生物（,pH,低于,2,）,嗜碱性微生物（,pH,大于,10,）,氢离子浓度,(pH,值）,大多数微生物来说，生长的环境,pH,值为,5-9,嗜酸硫杆菌的煎蛋形菌落,根据氧气的需求对微生物分类,:,专性好氧菌（,obligate or strict aerobes,）,兼性厌氧菌（,facultative anaerobes,）,耐氧菌（,aerotolerant anaerobes,）,厌氧菌（,anaerobes微好氧菌（,microaerophilic bacteria,）,超氧化物歧化酶（,SOD,）和过氧化氢酶（,Catalase,）,5.,氧气,三,.,有害微生物的控制,几个基本概念,物理因素,化学杀菌剂、,消毒剂,和治疗剂,几个基本概念,消毒,(disinfection),：,是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的,病原菌,营养体,的方法,。并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病,原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂。,灭菌,(sterilization),：,是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的,所有,微生物,，使之呈无菌状态。,灭菌比消毒要求高，包,括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。,抑菌,(bacteriostasis),：,抑制体内或体外细菌的生长繁殖。,常用的抑菌剂为各种抗生素。,防腐,(antisepsis),：,用理化方法防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。,细菌一般不死亡。,无菌,(asepsis),：,不存在活菌，多是灭菌的结果。,无菌操作（,antiseptic technique,）,防止微生物进入人体或物体的操作技术。,高温灭菌,辐射作用,高渗作用,干燥,超声波,控制微生物的物理因素,高温灭菌,多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在,50-65,，,10 min,可以致死。,一般噬菌体,65,80,致死。,放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，,76,80,10min,可以杀死。,细菌芽孢，在,100,下,20min,才能致死。,嗜热脂肪芽孢杆菌可在,80,条件下生活，,在,120,，,12min,才能杀死。,同种微生物老龄菌比幼菌耐热,。,高温灭菌,干热灭菌,(dry heat sterilization),湿热灭菌,(mosist heat sterilization),焚烧灭菌法：常用与废弃物动物尸体等处理。,烘烤灭菌法：实验室用干燥箱烘烤接种工具。,湿热灭菌,(mosist heat sterilization),煮沸灭菌法（煮沸消毒法）,高压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）,该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的,情况下容易凝固，如含水,50,，蛋白质凝固温度,为,56,；含水蛋白质凝固温度为,160-170,煮沸灭菌法（煮沸消毒法）,物品在水中煮沸,15min,，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。在水中加入的,a,2,CO,3,或的碳酸效果更好。此法适合注射器和解剖用具的消毒。,高压蒸汽灭菌,(normal autoclaving),是湿热灭中最好方法，,通常在,1.05kg/cm,2,的压力下,（此时温度,121,）,处理,15,30min,。,间歇灭菌法,(fractional sterilization),是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。,主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热的药物和营养物等。,方法是将待灭菌物品置于蒸锅内加热到沸腾维持,15-30min,杀死营养细胞，取出冷却后在,37,恒温培养,24,小时，使芽,孢萌发，再用此法灭菌，,反复三次,，即可达到灭菌目的。,巴氏消毒法,(pasteurization),是食品（牛奶）和酿造（啤酒）工业中常用的方法。,具体做法是,61.7,62.8,处理,30min,或,71.6,处理,15min,。,这样既可杀死病原微生物，又不致损坏营养，,可保留食品饮料原有风味。,根据：结核杆菌在,62,下,15min,被致死。,辐射,可见光,紫外线（非电离辐射）,X,射线与,射线,紫外线（非电离辐射）,杀菌机制：,诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰,了核酸的复制；,O,2,O,3,O,2,+,O,紫外线,各种微生物对紫外线抗性,干细胞强于湿细胞,芽孢，孢子强于营养细胞,多倍体 二倍体 单倍体,各种微生物对紫外线抗性,干细胞强于湿细胞,芽孢，孢子强于营养细胞,多倍体 二倍体 单倍体,高渗作用,等渗溶液对微生物生长有利,细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂,细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离,导致死亡,用物理阻菌的方法除去液体或空气中的细菌。,常用滤器：薄膜滤器、玻璃滤器、石棉滤器（,Seitz,）,特点：只能除去细菌，不能除去病毒、支原体、,L,型细菌。,应用：用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、,抗生素,，以及空气的除菌。,滤过除菌法,0.45,微米以下孔径的薄膜滤器,除菌滤膜与过滤器,是一种机械的作用因素，每秒超过,2,万次,振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生,20-100,千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。,超声波杀菌法,超声波清洗干燥灭菌机,控制微生物的化学物质,(,因素,),表面消毒剂,抗代谢物,抗生素,化学治疗剂,溶液状态,气体状态,生物药物素,酸和碱,重金属极其盐类,有机化合物,氧化剂,卤素,染色剂,表面活性剂,表面消毒剂,(surface disinfactant),酸和碱,微生物细胞中的,DNA,，,RNA,，酶等,只有在中性条件下才能体现活性，因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。,重金属及其盐类,是,杀菌剂和防腐剂,，作用最强的是,Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活（与酶的,SH,结合）,0.02,0.2,Hgcl,2,（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。,CuSO,4,对真菌、藻类有强杀伤力，波尔多（,CuSO,4,碳）防植物病害。,另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药。,0.1,1,AgNO,3,可消毒皮肤，,1,浓度新生儿点眼预防眼炎,有机化合物,醇、醛、酚是常用的杀菌剂。,杀菌机制,损伤细胞壁,使蛋白质变性（细胞膜，,E,失活）,抑制脱氢酶，氧化酶活性。,有机化合物,甲醛：纯甲醛为气体，,37,40,水液为福尔马林。,醇是脱水剂蛋白质变性剂，,70,乙醇杀菌效果最好。,酚：,3,5,的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲,酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥,皂的混合液。,卫生组织将福尔马林列为致癌物,2004,年,6,月,15,日,世界卫生组织下属机构国际癌症研究机构召集,10,个国家的科学家对,化学物质甲醛（俗名福尔马林,）的致癌性进行了研究，,进一步证实甲醛是致癌物质,。国际癌症研究机构表示，充足的例证显示甲醛导致鼻咽癌，强有力、但还不够充足的例证显示甲醛可以导致白血病。甲醛是重要的基本化工原料，它可以生成许多有用的化学品，如合成树脂、合成医药、合成香料、合成炸药、合成助剂等，甲醛在工也和生活中得到大量使用。,卫生组织提醒全社会对甲醛的致癌性有所了解，并采取措施预防患病。,联合国,氧化剂,K,2,MnO,4,使菌体蛋白质氧化，使酶失活。,0.1,3,浓度可用于皮肤、果品、餐具消毒。,H,2,O,2,清洗伤口。,酪氨酸,+I,2,二碘酪氨酸,卤素,碘杀菌力强，,3,7,碘溶于,70,83,的乙醇中成碘酒。,氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结,合放出原子氧（,O,）用于消毒。,氯，碘是常用的消毒剂,染色剂,干扰菌体氧化还原电位,阻碍芽孢的形成。,紫药水（龙胆紫）,近年来英国药理学家一项毒理试验却向世人宣告了一个令人难以置信的结果：紫药水是一种,潜在的致癌剂,。,表面活性剂,具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。,常用的有新吉尔灭等，去污剂，肥皂等。,表面张力降低可抑菌或杀菌。,抗生素,(antibiotic),是由微生物在代谢过程中产生（有的可人工合成）具有一定浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。,每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱,家庭实用消毒方法,食品消毒：,从口入的疾病有以下几类,:,人畜共患疾病,:,布氏杆菌、肺吸虫病、肝吸虫病等。,细菌性食物中毒：沙门氏菌，葡萄球菌、致泻性大 肠杆菌。,肠道寄生虫病：蛔虫病、扰虫病最常见。,霉菌毒素致病：黄曲霉菌产生的黄曲霉素（花生、花生油、大米、豆类，玉米），剧毒，可引起人与动物的急性中毒死亡，还有致癌性，长期食用可引起肝癌或其它癌症。,熟食品的消毒：,夏天，熟食品出锅后,5,小时就可能因细菌污染而腐败。,消毒的方法为加热消毒，微波炉是个好的选择。,剩饭菜的消毒：,餐后尽快加热（因中国人的聚餐习惯）,妥善储藏（冰箱冷藏）,食前加热（必须）,海产品的消毒：,海产品受海水中病原微生物的影响，可能带菌，如霍乱杆菌，甲型肝炎病毒等。,冲洗 对毛蛤、文蛤等贝类，先用自来水充分冲洗，以去除贝竞表面的泥污，再在清水中放置数小时，让其“吐砂”，然后，再冲洗。以便最大限度地消除含面的污物。,去污 海蟹的蟹鳃,(,蟹眉毛,),、蟹心,(,六角板,),、蟹胃,(,背甲前缘中央,),等处住含茵较多，不宜食用应丢弃之。,加热 弧菌不耐高温，80,度时即可被杀灭；甲肝病毒则至少,100,度加热,5,分钟，由于煮制海产品时，可能发生外熟内生的情况，故应在,100,度时持续加热,30,分钟以上，煮熟煮透，达到消毒的目的。,佐醋 弧菌对酸敏感，所以，生吃海蟹皮作凉拌菜时以及食用其他海产品时，均宜用食醋浸泡和佐醋食用。,霍乱弧茵和甲型肝炎病毒会污染餐具与厨具，故凡接触过生的海产品的容器与厨具应该用化学消毒剂消毒，或者，煮沸加热比分钟消毒，以防经容器与厨具污染其他食物，造成交叉感染。,生吃瓜果蔬菜的消毒：,瓜果蔬菜：先用自来水冲洗果蔬的表面泥污，用水浸泡,10,分钟，去处表面可能残存的农药，然后开水浸烫消毒，时间为几分钟；或者去处泥污后，用,0.1,的高锰酸钾溶液浸泡,2030,分钟，再用凉开水冲去高锰酸钾。高锰酸钾也可代之以“洗洁精”等消毒液。,拌凉菜的案板不应和熟食混用。,家用小型果汁机与菜汁机，制得的果汁与蔬菜汁要现作现饮，存放时间长了容易滋生细菌，产生亚硝酸盐，引起中毒。,烧烤食品的消毒：,食物中的蛋白在,280,度以上的高温下容易生成,3,4,苯并芘（读,pi,），同时食物与木炭、焦炭等接触会沾上多环芳烃类化合物，诱发胃癌和食道癌，所以从毒理学角度看，不应吃，至少是不应常吃烧烤食品。,烧烤食品产生胃肠道感染和食物中毒的原因：,原材料本身腐败变质,烧烤的食品多次被人手接触，染菌机率大。,烧烤用具不洁,调料不洁,烧烤用能源最好选用电力，温度控制在,200,度以下。,牛奶中可能含有的致病微生物有牛结核杆菌、布氏杆菌、沙门氏茵与其他杂菌。,人感染结核病的一个途径即是饮用了含有结核杆菌的牛奶。结核杆菌为嗜酸杆菌。不形成芽胞，离开牛体后，存活能力极强，可在自然环境中存活数月。,由于以上原因，人们,不,能饮用未经消毒处理的生牛奶。从农户购买的散装牛奶必须进行消毒处理，不能直接食用。,方法：,巴氏消毒法 此法不必将牛奶煮沸可最大限度地保存营养成分。,煮沸消毒法,微波炉消毒法 将奶盛在玻确瓶内，置微波炉中央用,650,瓦照射，见牛奶煮沸即停止照射。,牛奶的消毒：,食具的消毒：,先用洗涤剂和温水洗净后，根据家庭条件定期消毒：煮沸消毒：（,100,度，,5,分钟，预防肝炎病毒要,15,分钟）,蒸气消毒：（,90,度，,1020,分钟）,洗烫消毒：（热水反复洗涤，次数越多越好）,远红外线消毒：（,170,度,10,分钟可杀灭肝炎表面抗原）,高压锅消毒：（水开加压阀持续,1015,分钟，可杀死绝大部分病原体）,微波炉消毒：（,650W,照射,5,分钟）,食用含氯消毒剂：（,5%,漂白粉，消毒灵，优安净洗消液等）,碘伏消毒剂：（,0.0150.033%,，,25,分钟）,过氧乙酸消毒：（,0.51%,，浸泡,3060,分钟）,生活用品的消毒：,被褥消毒：,阳光下暴晒，,36,小时。,家有病人（特别是肝炎患者），经常拆洗被褥，棉花在阳光下暴晒数日，被罩、被单应在消毒剂中消毒）,电话机消毒：,手和唾液为病原微生物的主要来源。附着在听筒上的细菌和病毒有,480,种。,电话消毒膜（片）消毒，一般可使用,13,个月。,消毒剂擦拭：,0.2,洗必泰，效果可持续十天。,书籍的,消毒：,阳光暴晒：（,8,小时，并随时翻动）,微波消毒：（,650W,功率下，,510,分钟）,臭氧消毒：（家用臭氧消毒柜消毒，,1,小时）,钥匙的消毒：,60,以上的钥匙都带有结核杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等,40,多种致病菌。,水中煮沸,1020,分钟。,消毒液中浸泡,1030,分钟，清水冲洗。,（消毒剂：,75,酒精，,1,：,1000,的高锰酸钾）,每周最少清洗消毒一次。,2003,年,4,月,18,日，北京华泰劳务服务公司的消毒人员在北京市疾病预防控制中心技术人员指导下为国家图书馆喷洒消毒剂。,电脑的消毒,键盘中分离出的金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌分别可引起皮肤脓泡疹、消化道疾病,而键盘上的真菌可传播手癣等疾病,.,美国学者也研究发现,电脑键盘和鼠标上发现的有害细菌比公共厕所的细菌量高出了,400,倍,.,Its Not Broken.Its Dirty,这是英国电脑清洗公司,Mr.PC Clean,的一则广告语,.,该公司,2003,年,11,月成立以来,已经接到,185.59,万个清洗请求,.,2005,年起经营电脑清洗的万宗源告诉记者,他曾经为多家网吧和电脑培训学校提供过免费电脑清洗,希望借此打开市场,但这些网吧和学校大多表示不感兴趣。,微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以,保证微生物学研究及应用工作顺利进行,，因而微生物保藏技术也是保护微生物资源的一项重要基础工作。,微生物保藏技术,根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。,（,1,）菌种保藏技术的原理：,传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷藏。,沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。,真空冷冻干燥法保藏,冷冻法：低温冷冻（,-20,），,超低温,，液氮；液体培养物中常加,15%,左右甘油，速冻后保藏。,其他保藏方法：曲法，麦粒法，无水硅胶法等。,（,2,）保藏方法,（,3,）、菌种保藏中心,我国由于,1979,年,7,月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会,(CCCCM),-,-,普通微生物菌种保藏管理中心,(CCGMC),-,中科院微生物所,北京,(AS),真菌、细菌,;,中科院武汉病毒研究所,武汉,(AS-IV),病毒。,-,农业微生物菌种保藏管理中心,(ACCC),-,中国农业科学院土壤肥料研究所,北京,(ISF),。,-,工业微生物菌种保藏管理中心,(CICC)-,轻工业部,-,工业微生物菌种保藏管理中心,(CICC),-,轻工业部食品发酵工业科学研究所,南京,(ID),真菌,;,卫生部药品生物制品检定所,北京,(NICPBP),细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京,(IV),病毒。,www.china-cicc.org/,-,抗菌素菌种保藏管理中心,(CACC)-,-,中国医学科学院抗菌素研究所北京,(IA),；四川抗菌素工业研究所,成都,(SIA),新抗菌素菌种,;,华北制药厂抗菌素研究所,石家庄,(IANP),生产用抗菌素菌种。,-,兽医微生物菌种保藏管理中心,(CVCC),农业部兽医药品监察所,北京,(CIVBP),。,美国的“,美国典型菌种收藏所”,(ATCC),，保藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。,培养物（,culture,）,：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的,微生物群体。,纯培养物（,pure culture,）,：只有一种微生物的培养物。,纯培养,：把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯,化出来的技术，是进行微生物学研究的基础。,显微技术,：是进行显微观察时，显微镜的使用技术、标本制作,技术、观察技术及物体组成成分定性和定量分析技术。,一、微生物的分离和纯培养二、显微镜和显微技术,第五章 微生物的纯培养和显微技术,1.,无菌技术,微生物研究及应用中，在分离、转接及培养纯培养物时，防止被其它微生物污染的技术。,（,1,）微生物培养基及器皿的灭菌,培养基：人工配制的供生物组织及细胞生长、繁殖、积累代谢产物所需营养物质及环境条件。,（,2,）无菌操作,也称接种操作，在无菌条件下，把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器中进行培养。,2.,用固体培养基分离纯培养物,菌落（,colony,）：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长，繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。,一,.,微生物的分离和纯培养,培养平板（,culture plate,，也称平板或平皿）：融化的培养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。,（,1,）涂布平板法,（,spread plate method,）,适于大多数好氧微生物。,划线接种法,根据菌落特征进行鉴别和挑取单个菌落再进行纯培养，制备种子培养物,。,琼脂板的制备,（,2,）稀释倒平皿法（,pore plate method,）,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10,100 1000 10,4,10,5,10,6,10,7,2.plate out 0.1 ml,（,3,）平板划线法（,streak plate method,）,适于大多数非蔓延性的微生物。,划线分离法,分离培养的结果,细菌的菌落照片,固体培养法,液体培养法,好氧菌的固体培养,厌氧菌的固体培养,好氧菌的液体培养,厌氧菌的液体培养,试管培养,三角瓶（摇瓶）,台式发酵罐,高层琼脂柱,厌氧培养皿,Hungate rool-tube technique,厌氧罐,厌氧手套箱,微生物培养法,实验室培养法,生产实践中的培养微生物装置,固体培养法,液体培养法,好氧菌,-,曲法培养,厌氧菌,-,堆积培养,发酵罐,（,Fermenter,）,培养基平板,Different culture methods,Liquid Culture,Batch culture,Batch&Continuous culture,10 ml,20 ml-1 L,1 L-1000L,Fermentor,挂曲,小,曲,红,曲,近代人工踏制大曲,A whole process of DA-QU prepation,光学显微镜的发明，使人类发现了生物机体的基本组成单位,细胞及许多微生物，观察到了它们的微细结构；电子显微镜的发明，克服了光学显微镜分辨率的局限，使人们对细胞结构认识逐步深入到微观世界。,分辨率,：能分辨两点之间最小距离的能力。,反差,：标本区别于背景的程度。,二、显微镜和显微技术,光学系统：聚光镜、物镜、目镜；日光或电光作光源。最大放大倍数,1600,倍。,1.,显微镜的种类及原理,（,1,）普通光学显微镜,普通光学显微镜属于透射照明，即照明光线直接进入视野。采用特殊的聚光器，实行斜射照明，样品反射后的照明光线进入物镜，视野是暗的，样品是明的，反差增大。,（,2,）暗视野显微镜,F.Zernike,发明，基本原理是：光线通过不同折射率和厚度的标本时，直射光和衍射光的光程有差别，加快或落后的相位发生变化,产生相差，通过环状光澜和相位板，利用光的干涉现象，把光的相位差转变为肉眼可见的振幅差，使透明物体表现出明显的明暗差异，,可看到细胞内的某些细微结构,（,3,）相差显微镜（,Phase contrast microscope,）,有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线，并转放出一部分光波较长的可见光,荧光。用紫外线作光源，在暗背景下，发荧光的物体表现为光亮样本,荧光显微镜的原理；,可对细胞的特定物质进行定性、定量、定位分析。,自发荧光：激发光；,诱发荧光：诱导剂，单胺类物质，,甲醛熏蒸；,荧光染料染色：吖啶橙，溴化乙锭等。,（,4,）荧光显微镜（,Fluorescence microscope,）,电子枪发射的电子射线在几万伏的加速电压作用下，产生短波长高能电子束，带负电荷，具有光的波动性，电磁场（电磁透镜）起着透镜的作用，有聚焦特性；电子束照射到样品上，电子与样品发生多种效应，形成透射电子和散射电子,透射电镜的信号来源；样品不同部位的结构不同，散射电子的能力不同，透过样品的电子束发生疏密差别，荧光屏上就出现了明暗区；样本厚度要小于,0.1,，生物样品要用重金属染色。,（,5,）透射电镜（,TEM,，,Transmission electron microscope,）,（,6,）,分析电镜（,Analytic electron microscope,）：,收集特征性,X,射线作为元素分析信号；有,X,射线波谱分析仪：分析,X,射线波长；,X,射线能谱分析仪：分析,X,射线强度。,（,7,）,扫描电子显微镜（,SEM,，,Scan electron microscope,）,利用二次电子信号成像，观察样品的表面形态，即二次电子的数量与样品材料性质、样品表面状态相关。,（,8,）,扫描隧道显微镜（,STM,，,Scan tunneling microscope,）,确定样品表面形貌就可以确定。,（,9),原子力显微镜（,Atomic force microscope,）,：,利用激光监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面的形貌信息。,2.,显微观察样品的制备,（,1,）光学显微镜的样本制备,活体观察：压片（滴）法；悬滴法；菌丝埋片法。,染色观察,活菌染色法,死菌,正染色,负染色,：,简单染色法,鉴别染色法,革兰氏染色法,抗酸性染色法,芽孢染色法,荚膜染色法等,活菌,:,用美蓝或,TTC,（氯化三苯基四唑）等,作活菌染色,姬姆萨染色法,第六章 微生物的遗传变异和育种,本章目录,一,.,遗传变异的物质基础,二,.,基因突变和诱变育种,三,.,微生物的育种技术,科学家们研究了大量的,微生物与动植物的遗传变异,现象。如（,1,）杂交水稻给人类带来了巨大财富，解决了中国几亿人口吃粮问题；（,2,）转基因粮食为人类提供更多更丰富的食物；（,3,）人类基因组计划的实施，为人类抗御疾病，展示了更美好的前景，基因的突变又给人类带来过许多灾难；（,4,）癌症就是一种细胞的基因突变，引起细胞变化；（,5,）就是因为基因变异，引起了流行性感冒的在世界上多次大流行，每次流行造成几十万至几百万人的死亡，才有香港所有的鸡被屠宰的命运；（,6,）艾滋病等许多病毒病都是微生物基因变异的结果。,微生物遗传与变异的概述,有 关 概 念,“种瓜得瓜，种豆得豆”,遗传（,heredity)：,生物的亲代传递给其子代一套遗传信息的特性。,遗传型（,genotype)又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。,表型：,指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。,变异：,指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。,饰变：,是指外表的修饰性改变，意即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,一母生九子，九子各不同”,一,.,遗传的物质基础,核酸,是一切生物遗传变异的物质基础,。,DNA,的结构,DNA,是由四种核苷酸组成。即：腺嘌呤（,A,）、鸟嘌呤（,G,）、胸腺嘧啶（,T,）、胞嘧啶（,C,）,四种核苷酸的差异仅仅在于碱基的不同。每个核苷酸均含有环状碱基、脱氧核酸和磷酸根三种组分。,DNA,分子是由许多核苷酸连接在一起形成的多核苷酸长链。这条长链是双螺旋结构。即两条成对的，方向相反的，细长的多核苷酸链，彼此以一定的空间距离，在同一轴上互相盘旋而形成的一个双螺旋式扶梯，每条链均有脱氧核糖,-,磷酸,-,脱氧核糖,-,磷酸交替排列构成的。,RNA,的结构,RNA,的结构与,DNA,的结构相似，只是尿嘧啶（,U,）代替了胸腺嘧啶（,T,）。,核酸的复制,半保留复制：复制后的,DNA,分子，各由一条新链和一条旧链构成双螺旋结构。,三个经典实验：证明核酸是微生物遗传物质,（,1,）转化实验：,（,2,）噬菌体感染实验,（,3,）病毒的拆开和重组实验转化实验,1928,年，,Griffith,发现肺炎双球菌间的转化现象。,1944,年,Avery,证明转化本质是,DNA,。,实验材料：肺炎链球菌,肺炎链球菌,RII（Rough):,粗糙型菌落，不致病,SIII(Smooth)：,光滑型菌落，致病,1928,年，,Griffith,的转化实验,R,型菌,(,无毒）,S,型菌（有毒）,加热杀死,S,型菌,R,型菌（无毒）,+,加热杀死,S,型,+,怎么来的呢？,？,活的无毒（,R,）型细菌受到了死的有毒（,S,）型细菌的影响，转化为有毒（,S,）型,合理的解释：,1944,年，,Avery,的转化实验,从上述结果中可知,只有,S,型细菌的,DNA,才能将,肺炎链球菌,的,R,型转化为,S,型。而且,DNA,纯度越高,转化效率也越高。只取微量纯,DNA(610,-8,g),仍有转化能力。这就说明,S,型菌株转移给,R,型菌株的,决不是某一遗传性状(如荚膜多糖)本身,而是以,DNA,为物质基础的遗传因子。,二,.,基因突变和诱变育种,变异,基因突变,基因重组,诱变,自发突变,点突变,染色体畸变,碱基置换,移码突变,转换,颠换,缺失,添加,易位,倒位,缺失,添加,野生菌株,(,红色,),缺陷型菌株,(,灰白色,),每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。,如突变为10,-8,，即表示在1亿次分裂过程中，会发生1次突变。,突变率,:1.,基因突变,:,生物体内遗传物质的分子结构突然发生,可遗传,的变化,。,1,不对应性,：引起突变的因素和突变出的性状没有对应关系。,2,自发性,：自然状况下也可发生。,3,稀有性,：,10,-6,-10,-9,间。,4,独立性,：突变的发生一般是独立的。,5,诱变性,：采用某种方法、药品可使突变率增加。,6,稳定性,：新产生的性状是稳定的、可遗传的。,7,可逆性,：既可发生正向突变，也可发生回复突变。,突变的特点,:,2.,突变与育种,自发突变与育种,在自然界发生的称为自发突变。,生产中选育,定向培育,诱变育种,人为地在实验室采用某种物理或化学因素,诱发微生物的突变称为诱变。,诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,在促进其突变频率显著提高的基础上，从中挑选少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,在日常生产中微生物会以一定频率发生自发突变。此时可以抓住良机选育优良的生产菌种。,用某一特定环境长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行移种传代，是达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。培育新种的过程十分缓慢。,诱变剂,目前在实践上常用的诱变剂主要有：,紫外线,氮芥,硫酸二乙酯,N-,甲基-,N,-,硝基-,N-,亚硝基胍（,NTG,或,MNNG）,亚硝基甲基脲（,NMU）,后两种因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。,诱变,育种的步骤,：,原始菌种,纯化,斜面,/,肉汤培养,单孢子,/,单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,特点及效果,提高菌株的生产能力；,改进产品质量；,扩大品种、简化生产工艺；,速度快、方法简便、收效显著。,1945,时间,1943,1943,1943,1947,1955,1971,1977,目前,发酵单位,(U),100,250,500,850,850,8000,2,万,5,万,6,12,万,效价：指有效成分的浓度；,1667ug/ml,称为,1,单位,(U),。,青霉素产量与诱变育种,三,.,几种,育种技术的介绍,原生质体融合技术,有两株微生物菌株，各在某一方面有明显优势，如何把这两株的优势集中在一株上？,利用原生质体融合技术,需要解决的难点：,去除微生物细胞膜外的细胞壁，得到原生质体。,原生质体脆弱，需要解决培养问题。,原生质体融合技术应用,自絮凝颗粒酵母酒精连续发酵技术,具有自絮凝能力的粟酒裂殖酵母,(,Schizosaccharomyces pombe,),变异株和酒精发酵性能优良的酿酒酵母,(,S accharomyces cerevisiae,),变异株的原生质体融合株。,改菌株放大技术已经在安徽丰原生化新建,20,万吨燃料酒精装置中采用，于,2005,年,12,月开始试运行，悬浮床生物反应器的容积规模已经放大到,1000m,3,。,反应器的设备生产强度指标高,与传统的酒精发酵工艺相比,可提高,58,倍,实现了小设备、大生产。,生产过程实现了酵母细胞的固定化,省去了传统工艺的酒母制备过程,既简化了工艺操作,又在一定程度上降低了原料消耗。,清糖液发酵,不仅酒精精馏过程排出的污水污染物含量大大降低,仅为传统工艺的一半。,新菌种的优势,重组,DNA,技术,当今，重组,DNA,技术已经应用到许多领域，“克隆羊”、“抗虫棉”、“基因治疗”等等。但微生物作为现代生物技术的主角地位并没有改变。,重组,DNA,技术的两个策略：,基因工程（借鸡下蛋）把动植物或微生物的某些基因转移到大肠杆菌、酵母等比较简单的微生物细胞中，用这些生长快、生长能力强的微生物来生产原来只能由动植物细胞或其它微生物细胞中才能生产的蛋白质或多肽，特别是人或哺乳动物来源的一些药物。,代谢工程（脱胎换骨）通过改变某些代谢途径或引入新的代谢途径，以达到提高特定的发酵产物的产量，降低生产成本、生产新代谢产物的目的。,代谢工程对柔红霉素产生菌,SIPI-1482,进行,遗传操作，不但成功地使产物柔红霉素的发酵单位,提高了,3,倍，而且通过基因阻断与基因替换得到的,阻断突变株获得了新的代谢产物，经,HPLC,和,MS,检,测表明为原来无法生产的表柔红霉素和多柔比星。,代谢工程的应用实例,