DNA序列测定的应用与发展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,DNA序列测定的应用？,分析基因组核苷酸排列序列,分析基因序列,基因定点诱变的基础,基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础,确定DNA序列中蛋白质的编码区,测序技术的最近发展,1.商品化测序试剂盒 解决了质粒问题，节约了时间，但缺乏灵活性。,2.自动化测序仪 以酶学测序反应或放标测序产物为基础，微机处理。,3.热循环测序 使极少数测序产物线性放大。,4.测序商品化 60-180￥，搞定,思考题,1.DNA序列测定有哪几种类型？简叙它们各自使用的范围和特点。,PCR法,只需少量模板即可产生清晰可辨的序列条带；,测序反应可在高温下进行。,2.双脱氧链终止法测序的基本原理是什么？,在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3,-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3,位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5,-引物端和以ddNMP残基为3,端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。,3.化学降解法测序的基本原理是什么？如何提高其测序精确度？,基本原理：,用放射性核素标记待测DNA一侧末端,将标记DNA分为G、A+G、C+T、C四个反应体系,用不同的化学试剂处理不同的反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射性标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物,电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列,精确度？,反应在精心控制的条件下进行，以确保每一个DNA分子平均只有一个碱基被修饰，使每组反应得到长度从一个到数百个核苷酸不等的末端标记的分子。,4.双脱氧链终止法测序的主要试剂有哪些？,引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构,模板,DNA聚合酶,2，3-双脱氧核苷三磷酸,（,2,3-,d,i,d,eoxy,n,ucleoside,t,ri,p,hosphate,ddNTP,）,放射性标记dNTP,5.PCR循环法测序为什么在大规模测序中得到广泛的应用？,只需少量模板即可产生清晰可辨的序列条带；,能提高测序反应产生的信号，降低了操作的复杂性，且聚合酶用量少；,可在小量制备的模板上进行筛选反应；,测序反应可在高温下进行；,双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用，不用做预先碱变性处理；,一句话：由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列，因此，该法在大规模测序中得到广泛的应用。,Thank you!,