液体活检专业知识宣讲PPT培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,液体活检专业医学知识宣讲,Outlines,分子医学时代的入口,ctDNA,的研究进展和临床应用,CTC,的研究进展和临床应用,分子医学时代的入口,分子医学时代的来临,2006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤异常谱型，是“人类基因组计划”后又一重大科学研究。,2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包括致癌突变、甲基化和基因copy数变化等数据。,对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史转变！,精准医疗：,Precision Medicine Initiative,在恰当的时候给患者以精准的治疗,Delivers the right treatment at the right time,3,液体活检，分子医学的入口,“三驾马车”：,CTC,、,ctDNA,和外泌体,分子医学时代的入口,液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医疗”代表性的诊断技术。作为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技术，液体活检正进入发展的黄金时期，,Exosomes,活细胞分泌,，,40-100nm,，1个活细胞状况实时监控,指标,母细胞来源标志物（,RNA,蛋白质），可用于早期,诊断,稳定，含量较高，内容物多样性，受干扰因素,少,检测相对,简单,ctDNA,死细胞释放,，杀伤性治疗效果的实时监控,指标,ctDNA,是一组,Panel,，癌变标志物，没有组织特异性和无癌症分期的,区分,不稳定，含量较低，受干扰因素,多,CTC,中,晚期癌症指标,，目前主要,用于,预后,新的,研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到,CTC,正在向,活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物,选择,稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步,复发监控,用药指导,超早预警,早癌发现,鉴别诊断,疗效监控,预后评估,转移分析,药物选择,CTC,、,ctDNA,和外泌体的差异,分子医学时代的入口,CTC,、,ctDNA,和外泌体在肿,瘤各阶段的应用,血清蛋白标志物,血清,/,尿液外泌体蛋白标志物,（,中晚期诊断及疗效判断）,血浆甲基化标志物,血清外泌体,miRNA,标志物,尿液外泌体,RNA,标志物,（,早癌诊断、鉴别及疗效判断）,ctDNA Panel,外泌体,/,血小板,RNA panel,（,早筛预警及现实风险评估）,组织个体化用药标志物,ctDNA,用药检测标志物,CTC,预,后评估,分子医学时代的入口,ctDNA,的研究进展和临床应用,ctDNA,的来源,ctDNA,的研究进展和临床应用,标志组合（,panel,）,每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同,ctDNA,，包含不同的突变。,不断演变及变化,每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变化。,高度碎片化,碎片大小范围分布在从,30b-250bp,，多数在,140bp-160bp,。,含量少且变化大,cfDNA,中多数野生背景，不同,ctDNA,片段的含量从,0.01%,到,10%,；,超早期、高肿瘤特异性,，,但缺少组织和器官特异性,ctDNA,的特征,ctDNA,的研究进展和临床应用,ctDNA,的临床应用,无创、全面、实时、便捷,ctDNA,的研究进展和临床应用,ctDNA,指导用药,CAPP-Seq NGS,用于血浆,ALK&ROS1,融合检测,8,例患者在血浆中均检测出,ALK,或,ROS1,融合,接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小,-,AM.Newman,et al.Nat Med 2014,ctDNA,预后评估,1.ctDNA,有,PI3KCA,检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。,-,Breast Cancer Res Treat,2015,March,2.ctDNA,中,PI3KCA,拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。,ctDNA,的研究进展和临床应用,ctDNA,动态监测,ctDNA,的研究进展和临床应用,分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的,ctDNA,和活体组织切片,血液样本中的游离肿瘤,DNA,与活体肿瘤样本测序结果相匹配,J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86,ctDNA,的研究进展和临床应用,ctDNA,的研究进展和临床应用,中通量,数十个点检测,灵敏度高,低通量,数个点检测,灵敏度最高,高通量,上万个点检测,应用前景广阔,荧光定量,PCR,数字,PCR,NGS,测序,ctDNA,检测平台,ctDNA,临床应用瓶颈,NGS,在,ctDNA,上应用的难点,假阳性问题：需要,纠错技术,NGS,仪器本身问,题,：,NGS,是采用边合成边测序，合成过程掺入错误千分之几，甚至百分之几,，需要鉴别“真突变”,而不是引入的“假突变”。,2.多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”3.DNA上遗传SNP的干扰。,漏检问题：需要,补救技术,1.技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90%片段信息；,2.超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA片段遗失；,3.断裂点附近的突变，在靶向富集后多重PCR中无法扩增；,4.分析过程中无法分辨真实突变，真突变被舍弃。,ctDNA,临床应用瓶颈,ctDNA,靶向测序建库方法,Ion Ampli-seq,ABI,公司独有技术，通过,多重,PCR,靶向扩增目的片段，能够以,FFPE gDNA,和血浆,cfDNA,为模板进行建库,主要,特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位点过多可能需要分多个引物,pool,，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。,捕获,建库,+,单分子,标签,目前主流，技术相对成熟，,90%,研究者采用该方案，代表公司如,Guardant Health,、,Foundation,、,Roche,、吉因加、燃石等,主要特点：,DNA,探,针或,RNA,探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无法检测断裂点附近的突变位点,单链成,环单,分子标签,非,主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和,康、安,可,济等,主要特点：,DNA,分子单链成环，,RCA,扩增或多重,PCR,扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以增加位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率,，单,背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受,限）,ctDNA,检测技术尚在不断发展中，还需要提升精准度，避免假阳性，减少漏检；,临床大样本验证,ctDNA,技术和检测,panel,，包括从泛癌种到单肿瘤，尤其是肺癌等常见癌症的,ctDNA,检测,panel,的逐步临床转化；,除个体化治疗上的机会，更大的机遇上应放在预防和康复领域。,小结,CTC,的研究进展和临床应用,CTC,的来源,CTC,的研究进展和临床应用,CTC,的研究进展和临床应用,CTC,的研究进展和临床应用,Thank You,！,