放线菌次级代谢产物研究进展.pdf

大家专版夏焕章男博士教授博士生导师沈阳药科大学生命科学与生物制药学院院长微生物与生化药学学科主席 年博士毕业于中国协和医科大学微生物药学专业 国务院政府特殊津贴专家辽宁省“兴辽英才计划”教学名师 中国药学会抗生素专业委员会副主任委员中国医药生物技术协会酶工程与发酵工程专业委员会常务委员中国化工学会医药化工专业委员会委员辽宁省药学会常务理事、辽宁省抗生素专业委员会主任委员辽宁省微生物学会理事辽宁省微生物制药重点实验室主任 沈阳药科大学学报副主编中国现代应用药学中国抗生素杂志中国医药生物技术微生物学杂志编委 主要从事微生物药物生物合成和代谢调控研究 主持国家高技术研究发展计划、国家自然科学基金、重大新药创制项目子课题、教育部博士点基金(优先发展领域)、辽宁省高等学校优秀人才支持计划、辽宁省自然科学基金和企业项目 发表论文 余篇获中国发明专利授权 项基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:夏焕章 男教授博士博士生导师 主要从事微生物次级代谢产物生物合成机制研究:.通讯作者收稿日期:放线菌次级代谢产物研究进展夏焕章翟 航(沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院辽宁 沈阳)摘 要 随着耐药细菌和新型病毒的不断出现癌症的发病率和死亡率持续上升迫使人们不断寻找新的化合物来治疗疾病 放线菌次级代谢产物结构新颖作用独特具有抗菌、杀虫、抗肿瘤、免疫抑制等活性广泛应用于医疗、农业、食品等领域深入挖掘放线菌资源来开发新型抗生素潜力巨大 然而从自然界分离的放线菌生产目标化合物的能力较弱这直接影响其工业应用增加其生产成本因此构建目标化合物高产菌株显得尤为重要 本文以此为出发点从放线菌新药资源挖掘和放线菌产抗能力提高两个方面对近年来的研究情况进行概述为放线菌资源开发提供参考关键词 放线菌次级代谢产物沉默基因簇组合生物合成基因工程代谢工程中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.().微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .:.微生物可以产生结构多样、种类丰富的次级代谢产物是天然药物研发的宝库临床上应用的微生物天然药物主要来源于放线菌这些物质大多具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制、杀虫等活性广泛用于医药、农业和食品行业 随着超级耐药细菌的出现和肿瘤发生率的持续升高深入挖掘微生物次级代谢产物开发新作用机制和新结构母核的药物前体变得越来越迫切 除此而外为了降低药物成本高产菌株的构建是关键本文从放线菌新结构挖掘和高产菌株构建两个方面对近年来的研究进展进行介绍(图)为开发放线菌来源的新型药物提供参考图 放线菌新结构挖掘和高产菌株构建的策略.从放线菌中挖掘新结构放线菌是天然药物的重要来源有一半的抗菌药物是放线菌来源的在抗生素发现的黄金时代之后主要以化学修饰的方式对已发现抗生素的毒性、耐药性、物理化学特性等方面进行优化出现不断迭代的现象而从放线菌中分离有价值的新结构分子变得越来越难因为按照传统的筛菌模式分离得到的多是已发现的结构 拓展放线菌研究范围深入挖掘陆地和海洋来源的稀有放线菌进一步优化筛选方式对于先导化合物开发具有指导意义 随着放线菌基因组测序、基因组挖掘和基因编辑技术的成熟激活大量未表达的沉默基因簇、异源表达实验室条件下不生长微生物的基因簇、组合生物合成策略扩大非天然化合物库、蛋白质工程对关键酶改造等策略对于从放线菌中挖掘新型结构具有重要意义.挖掘稀有放线菌和优化筛菌方式自抗生素发现的黄金时代以来陆生放线菌一直是抗生素发现的主要阵地 近年来从海洋中分离的稀有放线菌可以产生结构多样的次级代谢产物具有独特的生物活性成为抗生素发现的新资源 等总结了海洋稀有放线菌产生的 种新的生物活性化合物具有抗菌、抗肿瘤、抗虫、抗疟疾活性其中小单孢菌属是化学多样性和独特生物活性的最丰富来源 等总结了海洋放线菌分离得到的 个化合物其中生物碱()、多酮类()和肽类()占比最大链霉菌属()、小单孢菌属()和诺卡菌属()是次级代谢物的主要生产者 除海洋来源的稀有放线菌 等对陆生来源和海洋来源的稀有放线菌产生的新天然产物进行了总结 年共报道 个新化合物主要涉及大环内酯类、聚酮类、蒽醌类、联吡啶类、多烯类这进一步证明稀有放线菌是新结构挖掘的宝贵资源具有成药潜力的新结构作为先导化合物被进一步研究 等从 株放线菌中 微 生 物 学 杂 志 卷筛 选 到 一 株 稀 有 放 线 菌.可以产生环肽类抗生素(图)它对结核分枝杆菌 为./并且对利福平、链霉素、环丝氨酸耐受的结核分枝杆菌具有同等的抑菌效力通过与()作用发挥抑菌效果图 化合物的结构图.传统的筛菌方式是基于抗菌活性的筛选并不是靶点导向的这使其在后续研究中面临以下问题:候选分子渗透性太差或者被细胞外排该化合物作用的靶点在哺乳动物中也存在可能具有毒副作用 为了优化传统的筛选方式基于靶点的全细胞筛选策略()被用于放线菌新结构的挖掘其原理是减弱靶点的蛋白表达量会提高该受试菌对抗菌分子的敏感度如果干扰组(降低表达量)抑菌圈大于不干扰组(不降低表达量)那么该抗菌分子则为该靶点的候选抑制剂 脂肪酸的合成对于细菌生长至关重要并且脂肪酸合成过程中的酶功能和酶结构在细菌和哺乳动物中不同这使得脂肪酸合成过程中的酶如、/、成为重要的抗菌靶点 默克公司建立了基于靶点的全细胞筛选平台 以、为靶点 从 个放线菌或真菌提取液中筛选到抗菌剂 、对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌均有优异的抑制能力 沈奔团队对 和(图)的生物合成过程进行研究二萜合酶 负责醚环的起源 负责醚键的形成/负责羟化、还原和氧化为该类化合物结构优化和产量提高奠定基础 含有噻唑的肽类抗生素早在 年已经被发现具有良好的抑菌活性如微球菌素()、硫链丝菌素()等由于水溶性较差所以这类化合物并未走向临床但是其独特的作用模式和较强的抑制耐药菌活性使其再次成为研究热点 等基于抗性的全细胞筛选设计了一种对噻唑霉素()敏感耐药株的双板活性筛选方案用于筛选噻唑霉素类似物该方案表现为敏感株抑菌圈大于耐药株抑菌圈并且非此作用机制的抗生素无这 一 差 异 最 后 在 中筛选到新的噻唑骨架 结构鉴定发现含有糖基修饰作为噻唑霉素衍生物被进一步研究.激活沉默基因簇随着对放线菌基因组数据的深入分析后发现一个基因组中有大约 个基因簇而的基因簇在实验室条件下处于沉默状态 因此激活放线菌中沉默基因簇是挖掘新结构的有效手段 目前激活沉默基因簇主要分为两个方面发酵过程方面和基因簇方面 在发酵过程方面包括改变培养基组成、优化培养条件、共培养、添加化学激发子等在基因簇方面包括敲除或过表达全局性调控子、激活途径特异性调控因子、替换目标基因簇的启动子、异源表达整个基因簇等策略金属离子作为化学激发子常常被用于激活沉默基因簇 等从深海热泉喷口处分离到.在发酵培养基中添加金属离子后产生了新化合物具有抑制枯草芽胞杆菌 期 夏焕章等:放线菌次级代谢产物研究进展 的 活 性 等以 为研究对象在 /氯化镍激活下可以产生两个新的芳香聚酮类抗生素/对铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌()、肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度小于 /自然条件下放线菌产生抗生素是为了抑制周围的微生物来争夺更多的生存营养可以看成是其他微生物的诱导作用激发了放线菌的产抗能力于是共培养其他微生物来模拟自然界的微生物相互作用也被用于激活沉默基因簇 等考察了不同类型细菌激活链霉菌沉默基因簇 的潜力变形杆菌的产生率()明显高于厚壁菌门(.)和放线菌门(.)的菌株 等将芽胞杆菌与海洋链霉菌共培养后分离得到一个新的环肽类化合物 具有抑制肿瘤细胞增殖和迁移的活性全局性调控因子在时机适宜时会调控多个基因簇的表达对菌体生长发育、形态结构、次级代谢产物的形成均有影响改变全局性调控因子的表达量是激活沉默基因簇的常用策略 目前报道的全局性调控因子包括、等 等以 为研究宿主过表达 后激活了 基因簇的表达 等敲除 中的 后发现 的合成被抑制而 基因簇被激活 等使用 和 技术对委内瑞拉链霉菌内源性调控网络进行干扰使用 敲低 并且使用 激活结构基因成功激活 的产生通过可编程的工具包对调控网络进行干扰可以有效地激活沉默基因簇 然而通过全局性调控因子来激活沉默基因并不总是成功的因为菌体内调控是非常复杂的网络式调节其细节需要进一步研究 如果将基因簇表达和基因簇调控分开避开复杂的调控网络将结构基因置于强启动子下重构基因簇或者直接在背景较为清晰的模式宿主中表达将是一种有效的手段但大片段基因的克隆和操纵是技术瓶颈转化相关重组技术()是利用酿酒酵母体内高效的同源重组作用获得大片段基因簇这使得异源表达基因簇成为可能 等报道了一种即插即用的沉默簇表达工具包括启动子模块、辅助模块和结构基因模块在强启动子作用下高效表达每个结构基因从而重构基因簇在变铅青链霉菌中成功激活了 的生产 等对 .基因组信息分析时发现一个和达托霉素合成基因高度相似的沉默的 基因簇利用 技术进行大片段克隆并删除推测的负调控基因和非必须基因然后在天蓝色链霉菌中异源表达成功获得一个新的脂肽类化合物 由于细菌中的基因表达是成串的所以激活沉默基因簇中多个结构基因可以看成激活沉默基因簇的多个操纵子为了将强启动子更容易地嵌入多个操纵子中 等使用酵母同源重组、基于营养缺陷的酵母选择系统和序列正交启动子盒开发了一个启动子工程平台以四环素基因簇验证该方法和天然活性簇效率相当然后在异源宿主中激活了沉默簇 的表达 等使用 敲入技术同时在 个链霉菌属中敲入强启动子激活了 基因组中一个 型 基因簇.基因工程和组合生物合成次级代谢产物的中间体因为含量低而难以分离得到作为次级代谢产物的类似物可能具有更优良的特性在生物合成途径解析的基础上利用基因工程策略可以大量积累次级代谢产物的中间体 等将匹马霉素合成过程中的 单加氧酶 失活后产生了 个匹马霉素类似物:脱羧甲基匹马霉素()、脱氧脱羧甲基匹马霉素()、羟基脱氧脱羧甲基匹马霉素()化合物 具有更强的抗真菌活性且毒性降低了.倍 制霉菌素类似物()被鉴定为一种独特的含有双糖的四烯类抗真菌大环内酯由假诺卡氏菌()产生其水溶性显著增加溶血活性降低 等通过定点突变失活了 模块 中的烯基还原酶产生了 体外和体内抗真菌活性和毒性研究表明其对白色念珠菌表现出相当的抗真菌活性但毒性低于两性霉素 这表明 可能是一种很有前途的候选药物 等将 生物合成基因簇中的 敲 微 生 物 学 杂 志 卷除生成 位置未羟基化的 该化合物具有更好的抗结核杆菌活性除了基因工程可以获得新结构组合生物合成策略也常用于扩展次级代谢产物多样性这与同源酶的底物宽泛性关系密切 聚酮类化合物的生物合成过程具有“装配线”特征利用组合生物合成策略将聚酮合成簇中的模块或者结构域进行替换重组有望合成新型的聚酮类化合物 等将红霉素基因簇 中的 用特异性识别丙二酰辅酶 的()、()、()替换得到 丢失甲基的 将 中的 用特异性识别丙二酰辅酶 的 替换得到 位丢失甲基的 和 阿维菌素和米贝尔霉素作为杀虫剂被广泛用于农业但仍然面临耐药问题和毒性问题伊维菌素 是将阿维菌素 的 位双键还原得到保持抗虫活性的同时大大降低毒性 等将阿维菌素合成簇中的 用米贝尔霉素合成簇中的 替换直接在阿维菌素产生菌中发酵生产伊维菌素产量达()/为了进一步获得新的伊维菌素类似物在上述菌株基础上将加载模块 替换为 获得了两个新的伊维菌素类似物它们在 位保持和米贝尔霉素一致的甲基取代这两个新化合物按照一定比例混合对抗秀丽隐杆线虫活性比伊维菌素高.倍比米贝尔霉素高.倍 糖基化修饰对于活性和物理化 学 特 性 至 关 重 要 等将 种不同的脱氧糖合成基因导入 产生菌中形成了 种新型 类似物在失活 谷氨酸合成酶后补加不同类型的氨基酸期望定向替换天然的起始单元添加 氨基戊酸时获得两个新化合物活性研究时发现有 个新化合物抗金黄色葡萄球菌活性提高抗肿瘤活性相当或降低.拓展关键酶的底物谱聚酮类化合物具有类似的碳骨架合成过程酰基转移酶()、酮合酶()、酰基载体蛋白()负责在聚酮链合成中添加延伸单元组合的酮还 原 酶()、脱 氢 酶()、烯还原酶()、甲基转移酶()负责改变酮基氧化态硫酯酶()负责释放和环化聚酮骨架经过糖基修饰后得到结构多样的聚酮类化合物所以聚酮结构多样性与 识别底物多样性、酮基氧化态、聚酮链长度、后修饰过程等因素关系密切 一般情况下 只识别丙二酰辅酶 和甲基丙二酰辅酶 如果可以扩展酰基转移酶的底物谱将有望合成新型的聚酮骨架但是 蛋白质工程仍然面临机制不清楚的问题等解析 晶体结构通过点突变对底物识别残基/进行研究并且对红霉素合成过程中的 进行改造得到突变体/对戊炔基丙二酰辅酶、庚烯基丙二酰辅酶 和苄基丙二酰辅酶 识别能力增强这为拓展聚酮骨架获得新型聚酮化合物提供参考 负责聚酮链的释放和骨架环化而对非天然底物不进行环化 等对 中的硫酯酶进行结构分析 获得突变体可以识别天然底物的异构体()产生苦霉素异构体这为拓展硫酯酶底物谱获得新聚酮结构提供参考 提高放线菌的产抗能力从自然界分离得到的菌株生产活性物质的能力一般不高这不仅无法满足工业需求而且会增加分离纯化的成本所以在新结构挖掘的基础上提高该宿主菌产抗能力成为首要任务 传统的诱变筛选育种过程费时费力若结合新技术对诱变过程和筛选过程进行优化则可大大提高效率再对其发酵培养基和发酵过程进行优化可以显著提高产抗水平 在分子层面使用基因工程和代谢工程策略对菌株的初级代谢和次级代谢过程进行改造成为构建高产菌株的有效手段这主要包括改变调控因子的表达量增加前体供应减少竞争途径的分流提高限速酶的酶量和酶活、基因簇重构和异源表达进一步将上述策略组合最大限度地激发宿主的产量能力.诱变育种和发酵优化策略通过诱变育种筛选高产菌株虽然面临工作量 期 夏焕章等:放线菌次级代谢产物研究进展 大、耗时耗力等问题但仍然是提高放线菌产抗能力的有效策略 除了传统的物理诱变(紫外线、射线)和化学诱变(亚硝基胍、甲基磺酸乙酯)外常压室温等离子体技术()在微生物诱变育种中的应用越来越广泛 依据产物的物理化学性质(紫外吸收、易反应基团)或生物性质(抗菌活性)建立高通量筛选方法是优化筛选过程的关键培养基优化和发酵过程优化被用于进一步提高目标化合物产量 可以生产大环内酯类化合物 具有良好免疫抑制活性 等以.为出发菌株通过 诱变筛选到高产菌株 结合响应面法优化培养基使 产量从/提高到 /随后以 为出发菌株将紫外线诱变与链霉素抗性筛选相结合筛选到菌株 使 产量从 /提高到 /等开发了一种利用链霉素抗性预筛选(/)和 孔板微孔板读数器(台盼蓝分光光度法)重筛选策略的高通量筛选方法通过六轮 诱变筛选到一株高产新霉素的突变株 效价为()/优化发酵培养基后效价增加到()/.基因工程和代谢工程策略.调控因子 等鉴定了 和 的生物合成基因簇敲除负调控子 后产量提高 倍二者产量分别为()/和()/可以生产多烯大环内酯抗生素龟裂霉素()可有效防治多种植物真菌病害 等敲除该菌中的全局性调控因子龟裂霉素产量提高 结构基因的转录水平均上调并且菌丝分化速度加快 米贝尔霉素因具有良好的杀虫活性被用于农业 发酵产生 /和/后者是米贝尔霉素化学修饰的重要前体 等发现 是/生产的正调控因子敲除 后 /的生成减少了 过表达 后 /的生成增加了 产生的阿维菌素也是一种重要的杀虫剂 等发现 家族的 是阿维菌素生物合成的正调控因子通过激活簇内的、抑制转膜外排蛋白 来促进阿维菌素的生成进一步在阿维菌素工业菌株 中过表达 产量提高 敲除产量提高(/).前体供应和竞争路径宿主积累前体物质的能力影响宿主产抗能力前体物质主要是从单糖、脂肪酸、氨基酸等营养物质转化而来通过前体喂养、操纵前体合成中的限速酶、改变前体竞争途径的流向是增加前体供应的常用手段 乙酰辅酶、丙二酰辅酶、甲基丙二酰辅酶 是聚酮类化合物的重要前体 等在 基础上过表达内源性巴豆酰辅酶 羧化酶 增加乙基丙二酰辅酶 过表达乙酰辅酶 羧化酶 来增加丙二酰辅酶使 产量从 /进一步提高到 /支链脂肪酸降解后可以产生大量乙酰辅酶 前体支链 酮酸脱氢酶()和乙酰辅酶 脱氢酶()可以将亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸转化为乙酰辅酶 前体并在聚酮合成过程中受到脂肪酸合成路径()的竞争为了降低 竞争路径的关键酶 的表达量 等将 启动子替换为弱启动子 过表达 和 产量提高.倍三羧酸循环中的琥珀酸辅酶 在甲基丙二酰辅酶 变位酶()转化下生成甲基丙二酰辅酶 将 和 同时过表达 产量提高.倍.限速酶的酶量和酶活在多步的生物合成过程中某一步生化反应可能受到终产物或中间产物抑制、簇内簇外调控等因素而成为次级代谢产物合成中的限速步骤有目的地增加限速酶的含量或者提高限速酶的活性有望提高发酵产物的发酵水平 在红霉素 合成过程中的两条途径中若 先对 位羟基化然后 在 进行甲基化会产生中间体红霉素 先进行甲基化再进行羟基化会产生中间体红霉素 二者生物活性低且副作用大是红霉素 分离纯化中的主要杂质 等通过调节羟化酶 微 生 物 学 杂 志 卷 和甲基转移酶 的酶量几乎完全消除了红霉素 和 的生成并将红霉素 的产量提高了 糖肽类抗生素()是半合成抗生素奥利万星的关键前体主要由 发酵生产而(.)和()是发酵过程中的主要杂质 个化合物的差异在于含有氯原子的数目不同 的氯原子含量最多卤化酶活性不足可能是杂质积累的主要原因过表达 卤 化 酶 并 增 加 其 拷 贝 数 杂 质(.)和()均大幅减少 成为主成分(/)含量提高 等在构建多杀菌素异源表达菌株时产生了一半的多杀菌素(端单甲基)杂质过表达甲基转移酶 后杂质几乎不再产生进一步过表达限速酶 来加强 的产物消耗使多杀菌素 产量提高.倍(/)杂质减少 等将甲基转移酶、裂解酶 和亚砜合酶 在大肠埃希菌中表达可以产生 /的麦角硫因 基于麦角硫酶分解麦角硫因产生有紫外吸收的羧酸衍生物原理建立了高通量筛选方法对 和 进行定向进化以提高酶活最优突变体 产生/的麦角硫因在 发酵罐中进行发酵过程优化后产量可达到./.异源表达和基因簇重构除了用上述策略对天然宿主改造外将感兴趣的基因簇在遗传背景清晰、基因操作成熟的模式宿主中表达是挖掘新结构、研究生物合成途径、生成更多次级代谢产物的常用策略而大片段克隆技术是实现上述过程的基础 从 衍生的 载体被用于克隆达托霉素基因簇使用已表征的基因探针在玫瑰孢链霉菌基因组文库中钓取到 的达托霉素基因簇鉴定了 个关键的合成基因并在变铅青链霉菌中成功表达 通过限制性酶切位点将大片段连接到含有穿梭和表达元件的载体上效率较低体内同源重组被用于大片段质粒的构建如在大肠埃希菌中 介导的线环同源重组()等利用该技术将链霉菌穿梭和表达元件 通过融合和重组两步安装到含有 完整基因簇的 骨架上并在.宿主中成功整合 等重构了多杀菌素合成基因簇将 个结构基因分为 个操纵子分别置于组成型强启动子下将其在白色链霉菌中异源表达相比于异源表达原始基因簇重构多杀菌素基因簇后产量提高了 倍达到 /.多策略的组合将上述提及的多种策略进行组合搭配可以最大限度地激发放线菌产抗能力 等以转录组数据为依据过表达正调控因子、过表达簇中的限速酶、减弱糖原合成路径、增强糖原磷酸化路径来提供更多的前体物质 使阿卡波糖产量从./提高到 /在发酵罐中分批补加葡萄糖和麦芽糖阿卡波糖产量可以达到./米卡芬净作为棘白菌素类抗真菌剂被广泛用于治疗侵袭性真菌感染 是米卡芬净化学合成的原料 等表 达 限 速 酶 和 来 优 化 的生物合成途径消除不需要的副产物过表达转录激活因子 的产量从./提高到./共表达、和 后进一步在 发酵罐中优化分批补料条件 的产量达到./为了提高 的发酵水平 等基于基因组测序和分析删除了假定的竞争途径、重构 生物合成基因簇、增加前体供应使 产量从./增加到/对其发酵过程进一步优化后在 发酵罐中 产量可达./展 望放线菌次级代谢产物在医疗、农业、食品等领域具有广阔的应用价值从批准上市的抗菌药物来看放线菌仍然是产生结构新颖、效果显著的药物分子的主力军 在耐药菌广泛存在、新型细菌、新型病毒不断出现的大背景下开发新药和提高产量是放线菌药物资源开发的两大主要目标 深入挖掘稀有放线菌资源、优化传统的筛菌模式是放线菌新药资源开发的方面之一在分子水平对次级代谢产物合成的基因簇进行研究具有重要意义 在提高放线菌产抗能力策略中在传统诱变育种的基础上取长补短建立灵敏高效的筛选方法并结合抗性筛选是提高产量的有效策略 在阐 期 夏焕章等:放线菌次级代谢产物研究进展 明生物合成途径的基础上通过基因工程和代谢工程来组合多种高产策略如增加或降低调控子的表达、增加前体供应、减少竞争途径、增加限速酶的酶量和酶活是构建高产菌株的一般策略但这仍然是基于次级代谢产物生物合成过程有限的知识之上 近年来 测序和合成成本的下降基因组学、转录组学、蛋白质组学的出现生物信息学的快速发展基因编辑技术的不断更新为我们更深入地了解菌体复杂的代谢网络奠定了基础这对于放线菌新药开发和产量提高具有重要的意义参考文献:.:.():.:.():.():.():.():.():./.():.():.():.():.():.():.():.:.():.():.():.:.():.():.():.():.():.():.:.微 生 物 学 杂 志 卷 .():.():.():.():.():.:.():.()().(.)():.():.():.():.().():.():.():./.():.():.():.():.():.():.():.:.()():.():.():.():.():.():.期 夏焕章等:放线菌次级代谢产物研究进展