酶类药物医学知识课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。,主要内容,：,一、概述,二、酶类药物的分类,三、酶类药物的制备,几种重要酶类药物的制备工艺,知识目标：,掌握酶类药物分类、应用和生产方法,掌握,SOD,的生产工艺,了解酶类药物的发展趋势,一、概述,1,、酶,(enzyme),的特点,酶具有高度专一性和催化效率,.,酶催化反应的反应条件温和,.,酶的催化活性在生物体内受到多种因素的调节,.,酶对底物的结构具有严格的选择性,.,2,、药用酶,是用于预防、治疗、诊断疾病的一类酶制剂,。,3酶类药物的发展历程,4,千多年前的夏禹时代就盛行酿酒；周朝已开始制醋、酱、豆豉（在霉菌蛋白酶作用下产生的风味食品）和饴糖（主要含麦芽糖）,.,1833,年，,Payen,从麦芽的抽提物中沉淀出一种对热不稳定的物质，它可促进淀粉水解成可溶性糖，人们开始意识到生物细胞中可能存在着一种类似催化剂的物质,.,1893,年,francs,用木瓜蛋白酶治疗白喉和结核性溃疡病，疗效较好,.,1896,年，,WKuhne,首先把这类物质称为,“enzyme”,，中文译为,“,酶,”.,1897,年,Buchner,成功地用不含细胞的酵母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存在于细胞内，并不依赖活细胞,.,1926,年,Sumner,首次提取出脲酶，并进行结晶。,20,世纪,60,年代中期以前，一般动植物来源的酶已陆续投入生产，随后，又向着生产各种微生物来源的酶和辅酶的方向发展。现已有二千余种酶被鉴定出来，已经应用的有,1211,多种其中有二百余种得到结晶。,二、酶类药物的分类,1.,消化酶类,胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，用于治疗消化不良、食欲不振、急慢性肠胃炎、消化功能受阻等。,2.,消炎（抗炎）,胰蛋白酶、糜蛋白酶等用于消炎、消肿、清疮、排脓和促进伤口愈合；,胶原蛋白酶用于治疗褥疮和溃疡；,溶菌酶可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、水痘、带状疱疹和扁平疣等,木瓜凝乳蛋白酶用于治疗椎间盘突出症；,胰蛋白酶还用于治疗毒蛇咬伤。,依照其功效和临床应用分类,3,心血管疾病治疗,弹性蛋白酶能降低血脂，用于防治动脉粥样硬化；,激肽释放酶有扩张血管、降低血压作用；,某些酶制剂对溶解血栓有独特效果。如尿激酶、,链激酶、蚓激酶、纤溶酶及蛇毒溶栓酶。,凝血酶可用于止血,。,4.,抗肿瘤酶类生化产品,用于治疗某些肿瘤，如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶等。,L-,门冬酰胺酶是一种抗白血病药物，它是利用门冬酰胺酶选择性地争夺某些类型瘤组织的营养成分，干扰或破坏肿瘤组织代谢，而正常细胞能自身合成门冬酰胺故不受影响。,谷氨酰胺酶能治疗多种白血病、腹水瘤、实体瘤等。,神经氨酸苷酶是一种良好的肿瘤免疫治疗剂。,尿激酶可用于加强抗癌药物如丝裂霉素,(mitomycin),的药效，,米曲溶栓酶也能治疗白血病和肿瘤等,5,、其他酶类生化产品,细胞色素,c,是参与生物氧化的一种非常有效的电子传递体，是组织缺氧治疗的急救和辅助用药；,超氧化物歧化酶,(SOD),用于治疗类风湿性关节炎、放射病，在抗衰老、抗辐射、消炎等方面也有显著疗效。,PEG-,腺苷脱氢酶用于治疗严重的联合免疫缺陷症；,DNA,酶和,RNA,酶可降低痰液黏度，用于治疗慢性气管炎；,透明质酸酶用于药物扩散剂；,青霉素酶可治疗青霉素过敏。,6辅酶类生化产品,辅酶或辅基在酶促反应中起着递氢、递电子或基团转移作用，对酶的催化作用的化学反应方式起着关键性决定作用。多种酶的辅酶或辅基成分具有医疗价值。,如烟酰胺腺、腺嘌呤二核苷酸,(NAD),、烟酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸,(NADP),、黄素单核苷酸,(FMN),、泛醌、辅酶,A,等已广泛用于肝病和冠心病的治疗。,辅酶,A,常与,ATP,、细胞色素,c,、胰岛素等组成复方制剂以增强疗效。,三、酶类药物的制备,1,、原料选择,（,1,）不同酶的用料选择,(,含量低）,（,2,）注意不同生长发育情况及营养状况,（,3,）原料来源丰富,（,4,）从简化提纯步骤着手,（鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿，减少肝糖原）,（,5,）如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后立即取材。,随着酶应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已逐渐转向微生物。,2,、微生物酶制剂高产菌株的选育,自然界分离筛选,.,物理、化学方法处理、诱变,.,基因重组与细胞融合技术,.,3,、微生物酶制剂生产发酵技术,菌株产酶的最适培养条件（培养基、温度、,PH,、通气量）,一系列工艺条件（灭菌方式、发酵罐型号）,（,1,）材料的预处理,动物材料的预处理,：,机械法,冻融,丙酮粉,微生物材料的预处理,:,干燥法：干燥后菌体产生自溶。,空气干燥法：适合于酵母，热稳定性好的酶。,真空干燥法：适合细菌,冷冻干燥：适合于较敏感的酶。机械法,酶法处理,4,、酶类药物的提取与纯化,（,2,）,酶的提取,水溶解法：常用稀盐溶液或缓冲液提取，一般在低温下操作，酸性蛋白酶用碱性溶液提取，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，盐溶度以等渗为好，,0.15mol/L NaCl,的离子强度是最适合酶的提取。,有机溶剂法,某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂类牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合的脂类，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。,表面活性剂法,表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故可以提取结合酶。,（,3,）酶制剂的工业提取法,发酵液的预处理及过滤：,在发酵液中加入絮凝剂（聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸）,酶液的脱色活性炭、脱色树脂）,盐析,有机溶剂法,喷雾干燥直接制备粉末酶制剂,（,4,）酶的纯化,凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化,.,注意两个问题：,1.,建立快速的测定酶活力的方法,2.,建立活力回收表,杂质去除,PH,和加热沉淀法,蛋白质表面变性法,选择性变形法,核酸沉淀剂法,酶与底物结合,脱盐(透析、凝胶过滤）,浓缩（超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、,冷冻浓缩和聚乙二醇浓缩）,酶的结晶-处于过饱和状态,盐析法,有机溶剂沉淀法,复合结晶法,透析平衡法,等电点法,酶分离和纯化过程的注意事项-（变性、辅因子的流失、降解）,1938,年,Marn,等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶,1969年,McCord,等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。,超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种：,（,1,）是,Cu.ZnSOD,，最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；,（,2,）是,MnSOD,，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体 和原核细胞内；,（,3,）是,FeSOD,），呈黄褐色，存在于原核细胞中。,1,、概述,超氧化物歧化酶,（,Superoxide dismutase,SOD,）,人类,SOD,酶的晶体结构,（彩虹彩色图：,N-,末端,=,蓝色，,C-,末端,=,红色）,结合铜（蓝,-,绿球）与锌（灰球）,线粒体,SOD,2,、,SOD,临床作用,3,、,SOD,的应用领域,（,1,）药物类,主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；,（,2,）生化制药,作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，可抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统；,（,3,）化妆品,可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以,SOD,为主要成份的化妆品风靡世界，引发了化妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真；,（,4,）保健食品、饮料,SOD,糖、,SOD,口服液、,SOD,干啤等都非常畅销。在饮料、糖果、糕点等食品中加入,SOD,既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统,。,4,、,SOD,的性质,对热稳定：天然牛血,SOD,可,75,加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关,对,pH,的稳定性：一般,pH5.39.5,较稳定，猪血,SOD,在,pH7.6,9,较稳定,金属辅基与酶活性关系,Cu,、,Zn-SOD,：,Zn,与分子结构有关，与催化活性无关,Cu,与活性有关，对酶活力是必需的,Mn-SOD,：,Mn,对酶活力是必需的,Fe-SOD,：,Fe,对酶活力是必需的,5,、,SOD,的制备,提取工艺要点：,溶血液制备：新鲜牛血以,3.8%,柠檬酸钠抗凝,血球分离机分离红细胞,加,2,倍无离子水,搅拌溶血,30 min.,选择性热变性：溶血液泵入夹层反应釜,搅拌、蒸汽加热至,68,加入适量蛋白质沉淀剂使血红 蛋白完全变性后,将反应液泵入冷却罐,搅拌机搅拌,迅速冷却至,15,按反应液总体积补加适量蛋白质沉淀剂,搅拌,1 h,甩干过滤去除变性血红蛋白,过滤液,3000rpm 20min,低速离心,去除颗粒沉淀物,.,超滤浓缩：上清液经微孔过滤去除细微颗粒,经超滤器超滤浓缩至总体积的,1/200,收集浓缩液,.,丙酮沉淀：超滤浓缩液预冷至,4,加入等体积预冷的工业丙酮,放置,1h,4000rpm 30min,冷冻离心,沉淀用少量无离子水回溶,对无离子水透析,12h,4000rpm 30min,冷冻离心,收集上清液,.,柱层析：经处理的,DEAE-52,装柱,用,2.5mM/L,缓冲液平衡,缓慢上样,用梯度洗脱,收集,SOD,部分,对无离子水透析,12h.,冷冻干燥 透析后的酶液经浓缩,置冻干机内冷冻干燥,升温速率控制在,5/h.,6,、,SOD,的检测,SOD,酶活力测定 采用邻苯三酚自氧化法,25,自氧化速率,0.07,pH8.2,50mM Tris-HCl,缓冲液,.,蛋白质浓度测定 采用,Lowry,法,以,250g/ml BSA,作标准曲线,.,分子量测定 采用,SDS-PAGE,电泳法,浓缩胶,3.5%,分离胶,10%.,紫外吸收光谱检测 扫描波长范围,230300 nm.,溶菌酶（,lysozyme,）,1,、概述,（,1,）溶菌酶（又称胞壁质酶、,N-,乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的,N-,乙酰胞壁酸和,N-,乙酰氨基葡糖之间的,-1,4,糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与,DNA,、,RNA,、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。,（,2,）,20,世纪初，英国细菌学家弗莱明（,Flemin,）在发现青霉素的前,6,年（,1922,年）发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶,。,。,（,3,）性质,：,其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚，,溶菌酶由,129,个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，,等电点在,pH10.8,左右，,分子量为,14000,，,化学性质非常稳定，当,PH,值在,1.2-11.3,的范围剧烈变化时，其结构几乎不变，,在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，,pH4.0-7,时，,100,处理,1min,仍能保持原油酸活性；,pH,值低于,4,时，能耐,100,加热处理，,在空气湿度较低时，溶菌酶可以长期在室温下存放。,2,、溶菌酶的制备,胰蛋白酶（,Trypsin,）,1,、概述,胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。,白色或米黄色结晶性粉末。,溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。,分子量,24 000,，,pI 10.5,，最适,pH,值,7.8,8.5,左右。,pH9.0,不可逆失活。,2,、临床应用,能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。,3,、,胰蛋白酶的制备（一）,可溶性固定化胰蛋白酶的制备,（二）,（,1,）载体的合成：将,2g,经过碱处理的壳聚糖,置于,40 mL,二甲亚砜中,在搅拌下加入,2g,丁二酸酐,于,65,反应,4-6 h,。反应结束后过滤,固相用乙醇浸泡,1 h,并将,pH,调到,10,左右。过滤后将沉淀物溶于蒸馏水中,用,4,倍体积的丙酮沉淀,沉淀物再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,40,真空干燥后得,N-,琥珀酰壳聚糖,。称取,1g N-,琥珀酰壳聚糖,溶于,20 mL,磷酸盐缓冲液中,调节,pH,至,45,左右,离心收集沉淀。将沉淀溶解于,20 mL,磷酸盐缓冲液,即得,载体溶液,。,（,2,）可溶性固定化酶,(soluble-immobilizedtrypsin,SIT),的制备,在磁力搅拌下向,20 mL,载体溶液中滴加入一定量的,5%EDC,1-,乙基,-3-(3-,二甲基氨丙基,)-,碳二亚溶液和,10 mL,胰蛋白酶磷酸盐溶液,(2 mg/mL),于,5-15,反应一段时间后,调节溶液,pH,至,45,左右,离心收集沉淀,用柠檬酸钠缓冲液,(02 mol/L,pH45),洗涤后,离心收集沉淀。沉淀溶于磷酸盐缓冲液,(02 mol/L,pH80),定容至,50 mL,即得,SIT,溶液。,尿激酶（,Urokinase,）,1,、概述,从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。,本品直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子,和凝血因子,等，从而发挥溶栓作用,分子式：,C21H25BrN2O3,分子量：,433.35,本品为白色状粉末,。,2,、临床作用：,用于急性心肌梗塞、急性脑血栓形成和脑血管栓塞、肢体周围动静脉血栓、中央视网膜动静脉血栓及其它新鲜血栓闭塞性疾病。,3,、重组人尿激酶原（,prouk,）的工业化制备,（,1,）重组人,prouk,工程菌的发酵,从,LB(,含,50g/mL Kan),平板上挑取,prouk,工程菌单菌落,于,500 mL LB,培养基中,经,37,、,180 r/min,培养约,12 h,后,接种至,10 L,种子罐,初始时设定温度为,37,pH 7.0,搅拌速度,200 r/min,通气量,5 L/min,溶氧,100%,打开酸泵,(2 mol/LHCl),和碱泵,(,浓氨水,),控制,pH,为,7.0.,逐渐增加通气量至,15 L/min,搅拌速度最终提高到,1 000 r/min.,发酵进行约,4 h,细菌生长进入对数期,OD600,可达,1215,移入,100 L,发酵罐,.,控制,pH,为,7.0,随着发酵的进行,溶氧逐渐下跌,可增加通气量和提高搅拌速度,.,约,3 h,后,OD600,增至约,1215,加入,IPTG,至终浓度,0.5 mmol/L,开始补充葡萄糖,(25%,葡萄糖终浓度为每升低于,1.5 g).,发酵过程中每,1 h,取样一次,测定,OD600,绘制生长曲线,当生长速度明显减慢,曲线达到基本水平时放罐,用连续流离心机,4,、,20 000 r/min,离心培养物,收集菌体并称量,-80,保存备用,整个过程约,1012 h.,（,2,）重组人,prouk,的活化,将已知重量的菌体,按,8 mL/g,湿重比例加入,裂解液,(100mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,pH 7.0),搅拌混匀,.,用弗氏压碎器,破碎,细胞两次,(16 00018 000 Lb/in2),待细胞裂解液冷至,4,时用超声匀浆仪,超声,直至溶液不再粘稠,.4,12 000 g,离心,30 min.,取沉淀物,(,包涵体,),悬浮在,9,倍体积的洗涤缓冲液,(100 mmol/L Tris,5 mmol/L EDTA,0.5%Triton,2 mol/L Urea,pH 7.0),中,洗涤,3,次,.,取洗涤后的湿包涵体约,1 000 g,溶解于,10 L,变性缓冲液,(10 mmol/L Tris-HCl,6 mol/L,盐酸胍,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L DTT,pH 9.0),氮气饱和,45,变性,12 h.4,8 000 rmin,离心,30 min,取上清,逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍,NaCl,Urea,GSSG,GSH,等的复性缓冲液中,反应终体积为,250 L,静置,24 h.,测定酶活力,参照,UK,标准曲线定出,prouk,活力含量,.,（,3,）,prouk,的分离纯化：,将,250 L,活化液超滤浓缩至,50 L,对,50 mmol/L HAc-NaAc,溶液,(pH 4.8),透析,.,透析液体积每次,250 L,每次,6 h,连续,4,次,.,将透析及过滤后活化液上,CM-,纤维素柱,(,直径,24 cm),流速约,3 L/h,经,50 mmol/LHAc-NaAc,0.1 mol/L NaCl,pH4.8,缓冲液洗涤后,用,50 mmol/LHAc-NaAc,0.5 mmol/L NaCl,pH4.8,洗脱液洗脱,收集洗脱峰,超滤浓缩后上,Superdex 75,柱,(60600 mm),每次上样量约,1 g,用,5 mmol/L HAc-NaAc,0.1 mmol/L NaCl,pH 4.5,缓冲液洗脱,.,（,4,）去热源：采用,Affi-Prep ploymyxin support,亲和层析,去除内毒素,调,prouk,样品,pH,至,6.0,并缓慢流过,Affi-PrepPolymyxin,层析柱,收集穿过液,并对,5mmol/L,醋酸透析过夜。,（,5,）冷冻干燥,