核磁共振波谱法医学知识.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,核磁共振波谱法,(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,NMR),1 NMR简介,2,NMR,基本原理,一.原子核能级的分裂及其描述,二.能级分布与弛豫过程,三.化学位移与自旋-自旋分裂,3 NMR仪器及组成,一.仪器分类,二.仪器组成,1,NMR简介,1.一般认识,NMR,是研究处于磁场中的,原子核,对射频辐射,(Radio-frequency Radiation),的吸收，它是对各种有机和无机物的成分、结构进行定性分析的最强,有力的工具之一，亦可进行定量分析。,在强磁场中，原子核发生能级分裂,(,能级极小：在,1.41T,磁场中，磁能,级差约为,25,10,-3,J),，当吸收外来电磁辐射,(109-1010nm,4-900MHz),时，,将发生核能级的跃迁,-,产生所谓,NMR,现象。,与,UV-,Vis,和红外光谱法类似，,NMR,也属于吸收光谱，只是研究的对,象是处于强磁场中的原子核对射频辐射的吸收。,氢原子的位置、环境以及官能团和,C骨架上的H原子相对数目,NMR spectra,2,2.发展历史,1924,年,：,Pauli,预言,了,NMR,的基本理论，即，有些核同时具有自旋和磁,量子数，这些核在磁场中会发生分裂,1946,年,：,Harvard,大学的,Purcel,和,Stanford,大学的,Bloch,各自首次,发现并证,实,NMR,现象，并于,1952,年分享了,Nobel,奖,1953,年：,Varian,开始商用仪器,开发,，并于同年制作了第一台高分辨,NMR,仪,1956,年,：,Knight,发现元素所处的化学环境对,NMR,信号有影响，而这一影,响与物质分子结构有关,1970,年：,Fourier(pulsed)-NMR,开始市场化（早期多使用的是连续波,NMR,仪器）,3,2002年，库尔特维特里希因“发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”而获得诺贝尔化学奖,4,NMR,基本原理,一.原子核能级的分裂及其描述,1.原子核之量子力学模型,带电原子核自旋 自旋磁场 磁矩,(,沿自旋轴方向),磁矩,的大小与自旋角动量,P,有关,（,为磁旋比）,：,PI(I+1),1/2,h/2,p,每种核有其固定,值（H核为2.6810,8,T,-1,s,-1,)。,5,当,核的质子数,Z,和中子数,N,均为偶数时，,I=0,或,P=0,，该原子核将没有自旋现象发生。如,12,C,，,16,O,，,32,S,等核没有自旋。,当,Z,和,N,均为奇数时，,I,=整数，,P,0,，该类核有自旋，但,NMR,复杂，通常不用于,NMR,分析。如,2,H，,14,N,等,当,Z,和,N,互为奇偶时，,I,=半整数，,P,0,，可以用于,NMR,分析，如,1,H,，,13,C,15,N,19,F,。,6,在无外加磁场时，核能级是简并的，各状态的能量相同,7,NMR,基本原理,其中,h,为,Planck,常数,(6.624,10,-27erg.sec),；,m,为磁量子数，其大小由自旋量子数,I,决定，,m,共有,2I+1,个取值，即角动量,P,有,2I+1,个状态！或者说有,2I+1,个核磁矩。,空间存在静磁场时，原子核自旋角动量在静磁场方向上的投影,8,对氢核来说，,I=1/2,，其,m,值只能有,2,1/2+1=2,个取向：,+1/2,和,-1/2,。也即表示,H,核在磁场中，自旋轴只有两种取向：,与外加磁场方向相同，,m=+1/2,，磁能级较低,与外加磁场方向相反，,m=-1/2,，磁能级较高,9,两个能级的能量分别为：,两式相减：,又因为，,所以，,即，,B,0,的单位为特斯拉,(T,Kgs,-2,A,-1,),1T=10,4,Gauss,也就是说，当外来射频辐射的频率满足上式时就会引起能级跃迁并产生吸收。,10,例：许多现代NMR仪器所使用的磁场强度为4.69T。请问在此磁场中，氢核可吸收多大频率的辐射？,11,2.原子核之经典力学模型,带正电荷的、且具有自旋量子数的核会产生磁场，该自旋磁场与外加磁场相互作用，将会产生回旋，称为进动,(Procession),。进动频率与自旋核角速度及外加磁场的关系可用,Larmor,方程表示：,此式与量子力学模型导出的式子完全相同。,0,称为进动频率。在磁场中的进动核有两个相反方向的取向，可通过吸收或发射能量而发生翻转。,可见，无论从何种模型看，核在磁场中都将发生分裂，可以吸收一定频率的辐射而发生能级跃迁。,12,13,3.几点说明,a)并非所有的核都有自旋，或者说，并非所有的核都会在外加磁,场中发生能级分裂！,b)当,核的质子数,Z,和中子数,N,均为偶数时，,I=0,或,P=0,，该原子,核将没有自旋现象发生。如,12,C,，,16,O,，,32,S,等核没有自旋。,c)当,Z和,N,均为奇数时，,I,=整数，,P,0,，该类核有自旋，但,NMR,复杂，通常不用于,NMR,分析。如,2,H，,14,N,等,d)当,Z,和,N,互为奇偶时，,I,=半整数，,P,0,，可以用于,NMR,分,析，如,1,H,，,13,C,15,N,19,F,。,Page 1,14,在一定温度且无外加射频辐射条件下，原子核处在高、低能级的数目达到热力学平衡，原子核在两种能级上的分布应满足,Boltzmann,分布：,15,例：计算在25,o,C时，样品在4.69T磁场中，其处于高、低磁能级原子核的相对个数。,16,当低能级的核吸收了射频辐射后，被激发至高能态，同时给出共振吸收信号。但随实验进行，只占微弱多数的低能级核越来越少，最后高、低能级上的核数目相等饱和从低到高与从高到低能级的跃迁的数目相同体系净吸收为,0,共振信号消失！,幸运的是，上述“饱和”情况并未发生！,17,二.能级分布与弛豫过程,(Relaxation Process),1.核能级分布,在一定温度且无外加射频辐射条件下，原子核处在高、低能级的数目达到热力学平衡，原子核在两种能级上的分布应满足,Boltzmann,分布：,通过计算，在常温下，,1,H,处于,B,0,为,2.3488T,的磁场中，位于高、低能级上的,1,H,核数目之比为,0.999984,。即：处于低能级的核数目仅比高能级的核数目多出,16/1,000,000,！,当低能级的核吸收了射频辐射后，被激发至高能态，同时给出共振吸收信号。但随实验进行，只占微弱多数的低能级核越来越少，最后高、低能级上的核数目相等饱和从低到高与从高到低能级的跃迁的数目相同体系净吸收为,0,共振信号消失！,幸运的是，上述“饱和”情况并未发生！,18,2.弛豫,何为弛豫？,处于高能态的核通过非辐射途径释放能量而及时返回到低能态的过程称为弛豫。由于弛豫现象的发生，使得处于低能态的核数目总是维持多数，从而保证共振信号不会中止。弛豫越易发生，消除“磁饱和”能力越强。,据,Heisenberg,测不准原理，激发能量,E,与体系处于激发态的平均时间(寿命)成反比，与谱线变宽,成正比，即：,可见，弛豫决定处于高能级核寿命。弛豫时间长，核磁共振信号窄,反之，谱线宽。,弛豫可分为,纵向弛豫,和,横向弛豫,。,19,纵向弛豫,1,：又称自旋-晶格弛豫。处于高能级的核将其能量及时转移给周,围分子骨架(晶格)中的其它核，从而使自己返回到低能态的,现象。,a)固体样品-分子运动困难-,1,最大-谱线变宽小-弛豫最少发生；,b)晶体或高粘度液体-分子运动较易-,1,下降-谱线仍变宽-部分弛豫;,c)气体或受热固体-分子运动容易-,1,较小-谱线变宽大-弛豫明显。,样品流动性降低(从气态到固态)，,1,增加，纵向弛豫越少发生，谱线窄。,20,横向弛豫,2,：又称自旋-自旋弛豫。当两个相邻的核处于不同能级，但进动,频率相同时，高能级核与低能级核通过自旋状态的交换而实,现能量转移所发生的弛豫现象。,固体样品,结合紧密,自旋核间能量交换容易,2,最小,谱线变宽最大,(,宽谱,),横向弛豫容易。,b),受热固体或液体,结合不很紧密,自旋核间能量交换较易,2,上升,谱线变宽较小,横向弛豫较易；,c),气体,自旋核间能量交换不易,2,最大,谱线变宽最小,横向弛豫最难发生。,样品流动性降低(从气态到固态)，,2,下降，越多横向弛豫发生谱线宽。,21,在相同状态样品中，两种弛豫发生的作用刚好相反，只是在液态样品中，二者的弛豫时间,1,和,2,大致相当，在,0.5-50s,之间。两种弛豫过程中，时间短者控制弛豫过程。,22,三.化学位移与自旋-自旋分裂,(Chemical Shift and Spin-spin Splitting),1.化学位移,现象：,大多数有机物都含有氢原子(,1,H,核)，从前述公式,可见：在,B,0,一定的磁场中，分子中所有,1,H,共振频率,0,一致，这时将,只,出现一个吸收峰，这对,NMR,来说，将毫无意义。,事实上，质子的共振频率不仅与,B,0,有关，而且与质子在化合物中所处的,化学环境,有关,换句话说，处于不同化合物中的质子或同一化合物中不同位置的质子，其共振吸收频率会稍有不同，或者说产生了化学位移！通过测量或比较质子的化学位移了解分子结构这使,NMR,方法的存在有了意义。,化学位移：,在一定的辐射频率下，处于不同化学环境的有机化合物中的质子，产生核磁共振的磁场强度或共振吸收频率不同的现象，称为化学位移。,600 Hz,B,23,2.化学位移产生原因及其表示方法,产生原因：,分子中的原子核处在核外电子氛围中，电子在外加磁场,B,0,的的作用下,产生次级磁场，该原子核受到了屏蔽：,B为核实际受到的磁场，,是由电子云密度决定的屏蔽常数，与化学结构密切相关。,Page 7,s=s,d,+s,p,+,s,a,+,s,s,24,2.化学位移产生原因及其表示方法,表示方法：,由于不同核化学位移相差不大，因此，实际工作中，化学位移不能,直接精确测定，一般以相对值表示。,于待测物中加一标准物质（如,TMS,），分别测定待测物和标准物,的吸收频率,x,和,s,，以下式来表示化学位移,：,无量纲，对于给定的质子峰，其值与射频辐射无关。,Page 8,25,在,NMR,中，通常以四甲基硅烷,(TMS),作标准物，,因为：,a),由于四个甲基中,12,个,H,核所处的化学环境完全相同，因此在核磁共,振图上只出现一个尖锐的吸收峰；,b),屏蔽常数,较大，因而其吸收峰远离待研究的峰的高磁场,(低频)区；,c)TMS,化学惰性、溶于有机物、易被挥发除去；,此外，也可根据情况选择其它标准物。,含水介质：三甲基丙烷磺酸钠。,高温环境：六甲基二硅醚。,26,3.影响化学位移的因素,从前式 可知，凡是影响屏蔽常数,（电子云密度）的因素均可影响化学位移，即影响,NMR,吸收峰的位置。,若结构上的变化或介质的影响使氢核外电子云密度降低,将使谱线的位置移向低场,这称做去屏蔽作用,反之,屏蔽作用使峰的位置移向高场,Page 28-32,27,3.影响化学位移的因素,1）诱导效应,(Induction),：取代基电负性越强-同碳氢电子云密度下降,(去屏蔽)-,下降,-产生共振所需磁场强度小-吸收峰向,低场,移动；,2）共轭效应,(Conjugated),：使电子云密度平均化，可使吸收峰向,高场或低场移动,；,与 C,2,H,4,比：,a),图：氧孤对电子与C,2,H,4,双键 形成 p-,共轭，,CH,2,上质子电子云密度增加，移向高场。,b),图：羰基双键与 C,2,H,4,-,共轭，,CH,2,上质子电子云密度降低，移向低场。,28,3）磁各向异性效应：置于外加磁场中的分子产生的感应磁场(次级磁场)，使分子所在空间出现屏蔽区和去屏蔽区，导致不同区域内的质子移向高场和低场。该效应通过空间感应磁场起作用，涉及范围大，所以又称远程屏蔽。,C,2,H,4,中,电子云分布于,键所在平面上下方，感应磁场将空间分成屏蔽区（+）和去屏蔽区（-），,由于质子位于去屏蔽区，与,C,2,H,6,（,=0.85）,相比移向低场,(,=5.28),。,C,2,H,2,中三键,电子云分布围绕,C-C,键呈对称圆筒状分布，质子处于屏蔽区，其共振信号位于高场,（,=1.8）,。,苯分子与,C,2,H,4,的情况相同，即苯的质子移向低场,（,=7.27）,；对于其它苯系物，若质子处于苯环,屏蔽区，则移向高场；醛基质子处于去屏蔽区，且受,O,电负性影响，故移向更低场,（,=7.27）,。,29,单键,C-C单键的,s,电子云也具有抗磁各项异性效应，但比,p,电子云要弱得多。C-C单键的去屏蔽区就是以C-C键为轴的圆锥体。,R,3,CH R,2,CH,2,RCH,3,CH,4,d（,ppm,）1.40-1.65 1.20-1.48 0.85-0.95 0.22,环己烷,(试验温度0;当两氢核相距偶数个键时,J,0,81,自旋耦合体系,1.定义 P54,2.命名 P55,82,自旋耦合体系,如何判断化学等价?,分子中的两个核通过对称轴操作可互换,这两个核在任何环境都是化学等价的,分子中的两个核通过对称面而互相交换,它们是对映异位的,在非手性溶剂中是化学等价的,但在手性溶剂中,它们化学不等价,若分子中两个核不能通过对称操作而相互交换则称为非对映异位,它们无论在任何溶剂中均化学不等价,83,84,潜手性中心,若分子中无手性中心,潜手性中心上的质子为对映质子;若有手性中心,潜手性基团的质子为非对映质子,手性中心对潜手性基团的影响,并不局限于直接连到手性中心上的潜手性基团,85,d,a,3.5,d,b,3.7,此处的手性与旋光异构体中的手性概念略有不同,手性中心,86,Applications,VAL in D2O,A,3,K,3,MX,87,2.命名,用英文字母代表系统中各个磁核,26个英文字母分为3组 A,B,C,M,N,O,X,Y,Z.,磁等价磁核用同一个字母代表,磁核数目用阿拉伯数字注在字母右下角,位移等价磁不等价的磁核，仍用同一个字母代表，仅在字母的右上角用标记，以示差别,如耦合磁核间的化学位移相差很小(,u,/J6,),这些磁核用不同组中的字母代表,自旋耦合体系,88,CH,2,=CF,2,AAXX,系统,CH,2,F,2,A,2,X,2系统,13,CH,2,F,2,AM,2,X,2,系统,CH,3,CH,2,OH A,3,M,2,X,系统,X-CH,2,-CH,2,-Y A,2,B,2,系统,AB,系统,AB,C,系统,89,自旋系统与一定的解析法相连,命名是为了寻求解析方法而进行的归类,90,核磁谱图的分类,一级谱图,u,/J20,一个自旋系统中不出现同组字母,并且位移等价质子都是磁等价质子,二级谱图,u,/J,u,/J6,91,核磁谱图的规律,一级谱图（一级规律）,一个,(,或一组磁等价,),质子与,n,个自旋为,I,的磁等价磁核耦合,则质子的信号发生,(2nI+1),重分裂,.,2.,若质子,A,与,M,n,和,X,m,两组或更多组磁核耦合,并且,J,AM,、,J,AX,等均不相同，,A,核共振信号裂分峰的数目为（,n+1)(m+1).n,和,m,分别是各组磁全同磁核的数目,CHFCF,2,OCH,2,CH,3,3.,若质子,A,与磁核,Xn,耦合,A,核信号所分裂的,(n+1),重峰,其峰间距相等,对称分布,.,相邻两峰之间的距离若用频率单位,Hz,表示,则就是它们的耦合常数,.,各裂分峰的强度比,(,从低场到高场,),为二项式,(,a+b),n,展开后各项的系数比,.,两组三重峰,92,核磁谱图的规律,一级谱图（一级规律）,4.一组多重峰的中点,就是产生该信号质子的化学位移,若,A,与,X,耦合,则,A,信号的裂距等于,X,信号的裂距,磁等价磁核之间,在实验中直接观测不到它们的自旋耦合分裂,所以这种耦合对图谱不产生影响,93,J,ab,=6.4Hz,J,bc,=3.6Hz,c b a,94,Jbc=6.7Hz,Jac=6.8Hz,95,核磁谱图的规律,近似一级谱图,裂分峰的数目、核间距与耦合常数的关系，仍符合一级规律，可按一级图谱来处理,近似一级谱图峰的强度不再以中心一个或两个峰对称分布，往往是相互耦合的两组峰间内侧峰强度大于外侧峰,96,Cl-CH,2,-CH,2,-CN,97,核磁谱图的规律,二级谱图,条件,u,/J6,或,系统内有位移等价而磁不等价的磁核,特点,1.,一般情况下,峰的数目超过由,2nI+1,规律所计算的数目,2.,峰组内各峰之间相对强度关系复杂,3.,一般情况下,d,、,J,都不能直接读出,从自旋体系角度讨论常见二级谱,98,二级谱图,AB,体系,AB体系,A,X,体系,A,2,体系,99,AB体系各参数 J,AB,d,A,d,B,P,56,100,101,二级谱图,AB,2,体系,CH-CH,2,-CH-CH-CH,AB,2,系统的线谱,Page 58，图2.15,AB,2,系统,1,H谱,Page 58，图2.16,102,103,8,104,二级谱图,ABX体系,105,Page,60 图 2.19,106,107,OH-C-CH,2,-CH-C-OH,108,二级谱图,虚假耦合和非真简单图谱,若A,B两个或两组强耦合的磁核,它们的化学位移之差很小,A与另外一磁核X耦合,而B不与它耦合,则X的信号可能会出现复杂分裂.,109,2,110,111,二级谱图,ABC自旋系统,最多十五条谱线,强度分布是中间高两侧低,AABB体系,谱线特点是左右对称,Page 62 图2.20,112,在氢谱解析工作中,当遇到二级谱时,如果非常复杂,往往并不一定要弄清每个质子精确的化学位移和它们的偶合常数.因为二级谱的某些峰形虽然复杂,但有关质子的,d,值不会超出复杂峰形所在的范围,信号强度与质子数的比例关系也能继续保持,利用这些定性关系,往往可以推断分子结构.113,114,常见的一些复杂谱,取代苯环,取代杂芳环,取代乙烯,正构长链烷基,Page,62-67,自 学,115,辅助谱图分析法(谱图简化法),使用高频仪器,1.,u,/J决定了谱图的复杂程度,400MHzNMR仪:,u,/J=,d,x,400/6=6.66,60MHzNMR仪:,u,/J=,d,x6,0/6=1,2.使用高频仪器,在简化谱图的同时,谱线信噪比也大为改善,假设,d=0.1,ppm,J,=6,Hz,116,117,辅助谱图分析法(谱图简化法),重氢交换,与O,N,S相连的是活泼氢,在溶液中它们可以进行不断地交换.如果样品中含有这些基团,在做完谱图后,滴加几滴重水,振荡,然后重新作图,此时活泼氢已被氘取代,相应的谱峰消失,由此可以完全确定它们的存在,重氢交换最经常使用的是,D,2,O,Na,OD,可以把羰基的a氢交换掉,118,辅助谱图分析法(谱图简化法),介质效应,利用苯,乙腈等分子的磁各向异性效应,CHCl,3,:Dd,0.2ppm,C,6,H,6,:,Dd,1ppm,C,6,H,6,119,辅助谱图分析法(谱图简化法),位移试剂,位移试剂本身是络合物,它和样品分子形成复合物,作用点处的官能团化学位移变化最大,Page 69,表2.12,120,辅助谱图分析法(谱图简化法),计算机模拟谱图,Page 70,121,辅助谱图分析法(谱图简化法),双共振(双照射)技术,在NMR扫频法实验中,除了使用一个连续变化的射频场H1扫描样品外,还同时使用第二个固定射频场H2照射样品,当选则不同强度的H2时,被干扰核被照射的频谱宽度不同,所得试验结果也不同,相应地也有不同地理论解释.,自旋去耦,NOE,122,辅助谱图分析法(谱图简化法),在NMR扫频法实验中,除了使用一个连续变化的射频场H1扫描样品外,还同时使用第二个较强的固定射频场H2照射样品,若要观察分子内特定质子与哪些磁核耦合,就调整H2的频率等于特定质子的共振频率.由于H2比较强,特定质子受到H2照射后迅速跃迁达到饱和,因此将不再与其它磁核耦合,得到的是消除质子与其它磁核耦合的去耦谱.对照去耦前后的谱图就能找出与该质子有耦合关系的全部质子.,自旋去耦,123,辅助谱图分析法(谱图简化法),自旋去耦,同核自旋去耦:,1,H,1,H,异核自旋去耦:,13,C,1,H,Page 70 (C2-17),Page 72,图2.23,124,NOE,效应,(,核,Overhauser,效应,),空间位置靠近,(,13,C-NMR Spectrum,135,THNMR,YAN,Applications -P(HB-MC-LC),OVERLAP for complex compounds!,136,Applications,VAL in D2O,A,3,B,3,MX,137,THNMR,YAN,Applications,LYS in D2O,138,Applications,HIS in D2O,AMX+AX,139,THNMR,YAN,Applications,THR-VAL-LEU in D2O,140,