核酸检测医学知识课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,主要内容,为什么要做核酸检测？,核酸是什么？,怎样进行核酸检测？,市场状况,为什么要做核酸检测？,核酸检测（基因检测）,现知,人类的疾病都与基因有直接或间接,的关系,。,医学实验室所要检测和分析的核酸,既包括人体本身的基因,(,DNA,),以及反映基因,转录水平的,mRNA,也包括侵入人体的致病,微生物等所携带的外源性基因,(,DNA/RNA,),。,传统检测试剂（酶免,ELISA,）,技术特点,：,检测目标为蛋白,所检测的主要是疾病所引发的人体抗体而不是病原体本身,是一种间接、滞后的检测方式。易操作，成本低。,固有不足,：,不能够消除对,“,窗口期,”,标本,(,抗体阴性,核酸阳性,),的漏检,难于检测病原体的不同亚型及突变型,不典型血清阳转,对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检,核酸检测,显著缩短窗口期,:HIV,窗口期缩短,45%,，,HCV,缩,短,89%,，,HBV,缩短,50%,。,提 高 灵 敏 度,:,理论上扩增体系中单拷贝的模板,也能被检测出。,特 异 性 好,:,使用荧光探针技术的,PCR,检测，,几乎没有方法学的假阳性。,直接揭示病原体的存在,对操作者及检测环境的要求较高,检测成本相对较高,输血中可传染病原体的“窗口期”,病毒种类,ELISA,检测项目,窗口期,HCV,抗,-HCV 2.0/3.0 EIA,8-10,周,HIV,抗,-HIV-1/2 EIA and HIV-1,抗原,EIA,2-4,周,HBV,HBVsAg EIA and HBVcAg EIA,6-8,周,HTLV,抗,-HTLV I/II EIA,8-10,周,CMV,抗,-CMV EIA,3-5,周,窗口期检测率,国家或地区,HBV,HCV,HIV,加拿大,1:153000,(,1/15万),1:2300000,(,1/230万),1:7800000,(,1/780万),法国,1:640000,(,1/64万),110000000,(,1/1000万),1:3150000,(,1/315万),德国,1:230000,(,1/23万),1:670000,(,1/67万),1:2770000,(,1/277万),日本,（,50,混）,1:51988,(,1/5.2万),1:348091,(,1/35万),1:2668696,(,1/267万),美国,（,24,混）,1:180000,(,1/18万),1:230000,(,1/23万),1,2,:3,7164054,(1/309万),香港,1:32786,(,1/3.3万),1:5456,(,1/0.5万),1:222,(,1/0.02万),核酸检测,在临床诊断中的应用,定性诊断,血液筛查,病原体筛查诊断,SNP和耐药突变诊断,基因型分型,遗传病诊断,个体用药诊断,基因鉴定和配型,定量检测,病情的评估和预后判断,抗病毒药物疗效的观察,新药验证,癌基因表达差异,核 酸 是 什 么？,核酸,（,Nucleic Acid,）是一种主要位于,细胞核,内的,生物大分子,，其充当着生物体,遗传信息,的携带和传递。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、,微生物,内。,现已发现近,2000,种遗传性疾病都和,DNA,结构有关。,肿瘤,的发生、,病毒,的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。,核酸分类：DNA、RNA；,DNA：dATP（A）,、,dTTP（T）,、dCTP（C）,、,dGTP（G）,；,RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；,3,5磷酸键,DNA结构,单链,DNA,形成双链的原则,碱基互补配对：,G-C T-A,外部为磷酸和戊糖形成,的骨架,内部为碱基互补形成的,共价结合区域,螺旋结构,核酸在体内的复制,DNA的热变性,DNA,受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温会恢复双链状态,怎样进行核酸检测？,核酸检测的一般流程,核酸样品的制备：,从血液、体液、组织中提取或PCR扩增,样品的检测：,核酸杂交、PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA等,结果判读：,电泳、膜、荧光定量PCR仪等,核 酸 杂 交,核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为,DNA,印迹交（,Southern blot hybridization,）和,RNA,印迹杂交（,Northern blot hybridization,）。,核酸提取,PCR,扩增,探针点膜,交联,杂交,显色,结果判读,PCR,聚合酶链式反应,(Polymerase Chain Reaction),，简称,PCR,，是一种分子生物学技术，用于放大特定的,DNA,片段。可看作生物体外的特殊,DNA,复制。,DNA,的复制是生物进化和传代的重要途径。双链,DNA,在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在,DNA,聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，,DNA,在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制,DNA,的变性和复性，加入设计,引物，,DNA,聚合酶、,dNTP,就可以完成特定基因的体外复制。,PCR的产生,实时荧光PCR,在PCR反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积实现了,实时监测,整个PCR进程，对,起始模板,进行分析的方法,可以进行定量和定性检测。,荧光阈值,是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的,循环数,被称为,CT 值,（threshold value）。,荧光定量,PCR,标记方法,内掺式染料,SYBR Green I,序列特异性探针,Taqman,Molecular Beacons,Dual Probes(,FRET),引物特异性探针,Amplifluor(Intergen),SYBR,GREEN,双,探针,杂交,分子,信标,Taqman,引物特异,探针,性质,可逆荧光,积累荧光,熔点分析,能,不能,特异性,引物（非,特异性扩,增或引物,二聚体有,影响）,引物,2,探针,引物,探针,引物,探针,引物（非特,异性扩增或,引物二聚体,有影响）,探针,无,有,有,有,无,通用性,通用,专用,专用,专用,专用,探针特点,SYBR Green,融,解曲线分析,SYBR Green法优缺点,优点:,对DNA模板没有选择性,适用于任何DNA,使用方便-不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,TaqMan探针法,TaqMan法优缺点,市 场 状 况,生产厂家,检测项目,使用技术,使用仪器,达安基因,HBV,、,HIV,、,HCV,、,HPV,、,TB,、,HCMV,、淋球菌、解脲脲原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒,型、,地中海贫血、缺失型,-,地中海贫血、,淋球菌、血筛试剂,PCR,荧光探针法,PCR-,反向点杂交法,荧光定量,PCR,仪,PCR,仪,上海科华,HBV,、,HCV,、,新型冠状病毒、,血筛试剂,PCR,荧光探针法,PCR-,酶免,荧光定量,PCR,仪,酶免相关仪器,匹基,HBV,、,HIV,、,HPV,、,TB,、,HCV,、沙眼衣原体、新型冠状病毒,PCR,荧光探针法,荧光定量,PCR,仪,上海华美,HBV,、,HCV,、,TB,、,沙眼衣原体、新型冠状病毒,PCR,荧光探针法,荧光定量,PCR,仪,上海克隆,HBV,、,TB,、,HPV,PCR,荧光探针法,荧光定量,PCR,仪,凯普、港龙以,HPV,检测为主。浩源血筛试剂已进入审批阶段。罗氏、生物梅里埃公司有,HIV,检测试剂盒，均以各自公司的专利技术为主研发。,现状和趋势,1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；缺乏规范；核心技术少；,2、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器进入市场；,实时荧光PCR检测的难点,1、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术,2、适合筛查应用的多重PCR技术,3、高通量全自动的核酸提取设备和耗材,4、高通量检测设备和配套耗材的成本控制,5、质量控制和质量管理方法,6、核心原料的成本控制,试剂质量控制方法,1、实验室分类和功能化,2、人员培训和自我约束,3、建立切实可行的质量控制方法,和管理体系,谢谢大家！,