核酸的结构主题医学知识.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,核酸（,DNA,、,RNA,）是遗传信息的载体,生命活动中居核心地位,基因工程引领现代生物技术,基于核酸研究成就,基因组测序、功能基因组研究,现代生命科学所有分支,第一章 核酸的结构,一、概述,1.核酸结构研究的作用,1865，Gregor Mendel,创立遗传学基因,1911，Thomas H.Morgan（美）染色体遗传理论：基因在染色体上呈线状排列（The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933）,作用,生物进化；农业、医药,问题,基因组成？基因控制功能？基因复制？,Mendel,Morgan,基因的物理性质？,1918,，,MDelbrck,（徳）“论基因突变和基因结构的性质”，噬菌体团队，基因复制,亲代噬菌体颗粒如何在半小时内产生上百个子代颗粒（,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,）,1944,，,Erwin Schrodinger,（奥）,生命是什么？,活细胞的物理面貌,：基因是遗传信息携带者；由连续的几种符号重复组成,Delbrck,Schrodinger,基因的化学本质？,1868,，,Friedrich,Miescher,（瑞）,从脓细胞核中分离出了一 种含磷酸的,有机物，核素（,nuclein,）,核酸（,nucleic acid,）,1877,，,Albrecht Kossel,（徳）细胞核中的非蛋白组分,核酸，分离出各种嘌呤、嘧啶，核糖（,The Nobel Prize in Physiology or Medicine,1910,）,Miescher,Kossel,DNA是遗传物质,1944,，,Oswald Avery,（美）细菌转化实验,1952,，,Alfred Hershey,（美）,&Martha Chase,（美）,Hershey-Chase experiments,噬菌体侵染实验（,Hershey The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,）,1953,，,James Watson,（美）,&Francis Crick,（英）,DNA,双螺旋结构（,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962,）,Waston（美）&Crick（英）,James Dewey,Watson，1928,Francis Harry Compton Crick，19162004,Happy Birthday,Double Helix,爱尔兰科学家,Maurice Wilkins,为DNA结构确立作出贡献的其他几位科学家,英国女科学家,Rosalind Franklin,美国化学家,Linus Pauling,DNA纤维X-衍射图谱,Wilkins,Franklin,Waston&Crick 发表在nature 上的文章,DNA double helix,核酸研究进展,1957,，,Mathew,Meselson,&,FranklinStahl,DNA,的半保留复制,1958,，,Francis Crick,中心法则,1972,，,Paul Berg,（美）,recombinant DNA,（,Nobel Prize in Chemistry 1952,）,1973,，,S.Cohen,&,H.Boyer美）,gene cloning,1975-1977,，,Frederick Sanger,（英）,DNA Sequencing,（,Nobel Prize in Chemistry 1980,）,1990,，,Human Genome Project,RNA世界,1980,，,Thomas R.,Cech,（美）,Ribozyme,（,the Nobel Prize in Chemistry 1989,）,1986,，,BenneRNA editing,RNA interference(,RNAi,),：,1995,，康乃尔大学的,Su,Guo,&,Kemphues,秀丽线虫；,1998,华盛顿卡耐基研究院的,Andrew Fire,和马萨诸塞大学癌症中心的,Craig Mello Nobel Prize in physiology or medicine 2006,microRNA,&,piRNA,：,1993,，,Lee RC,Feinbaum,RL,Ambros,V.,线虫,Lin,-4,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 jointly to Elizabeth H.Blackburn(USA),Carol W.Greider(USA)and Jack W.Szostak(USA)for the discovery of,how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase,Elizabeth H.Blackburn,University of CaliforniaSan Francisco,CA,USA,Carol W.Greider,Johns Hopkins University School of MedicineBaltimore,MD,USA,Jack W.Szostak,Harvard Medical School;Massachusetts General HospitalBoston,MA,USA,复制的半不连续性,semi-discontinuous replication,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链/前导链,(leading strand),随从链/滞后链,(lagging strand),冈崎片段,okazaki fragment,DNA两条链都可作模板,DNA链合成方向：,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,真核生物染色体DNA呈线状，复制在末端停止。,5,功能,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制（生殖细胞）的完整性,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,端粒(telomere),真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,结构特点,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G/C,碱基的短,序列（,进化上高度保守）,，人,TTAGGG,。,端粒（,Telomere,）,端粒酶(telomerase),组成,含有RNA的DNA聚合酶,端粒酶,RNA(human telomerase RNA,hTR,),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associated,protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse,transcriptase,hTRT,),四膜虫,拟南芥,端粒酶的作用,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,2009 Nobel Prize in,Chemistry,Venkatraman Ramakrishnan、Thomas A.Steitz and Ada E.Yonathwill share The Nobel Prize in Chemistry 2009 for studies of the structure and function of the ribosome。,2.核酸结构研究的主要方法,X-,光晶体结构分析：,利用晶体形成的,X,射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。将具有一定波长的,X,射线照射到结晶性物质上时，,X,射线因在结晶内遇到规则排列的原子或离子而发生散射，散射的,X,射线在某些方向上相位得到加强，从而显示与结晶结构相对应的特有的衍射现象。,核磁共振（,nuclear magnetic resonance),：,半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂。若以某特定频率的射频脉冲激发该自旋系统，则原子核就能吸收能量从低能态跃迁到高能态。这种跃迁称为核磁共振。检测电磁波被吸收的情况就可得到该核磁共振波谱,(1D-NMR,谱,),。,二、DNA的结构,1.核苷酸残基中各基团的性质影响核酸的特性,磷酸基团的pK1，使核酸呈酸性（在细胞中以“盐”的形式存在）；,呋喃核糖（或脱氧核糖）的构象影响核酸链的空间结构；,RNA的2-羟基使RNA比DNA具有更活泼的化学性质；,2.Chargaff定律及DNA纤维X射线衍射分析Waston-Crick模型,X,射线衍射图照片由两区域组成：碱基的有规则空间排列；链的空间构型,十字形螺旋形式,顶端,-,底部黑色区域碱基相距,0.34nm,，规则叠加，垂直于螺旋轴,两种周期：,0.34nm,；,3.4nm,两条链,Watson-Crick模型,3.DNA半晶体X射线衍射更精确的结构信息,Waston-Crick模型,：一周螺旋10bp，核苷酸间夹角36,度DNA结构的平均特征,Dickerson,：脱氧核糖核苷酸十二聚体X射线衍射,一周螺旋平均10.4bp，核苷酸间夹角28-42,度；碱基对非共平面,碱基对的螺旋桨扭曲,Dickerson：螺旋桨扭曲 提高碱基堆积力,4.DNA的结构可受环境条件的影响而改变 DNA能以多种不同的构象存在,Watson-Crick,结构：生理条件下具随机顺序,DNA,的最稳定结构,B,型,DNA,生理条件下,RNA,双螺旋和,DNA-RNA,杂合双螺旋中有与,A,型,DNA,相似的结构。,类型,结晶状态,A,Na盐，相对湿度75%时结晶,B,Na盐，相对湿度92%时结晶,C,锂盐，相对湿度66%时结晶,B-DNA与A-DNA,B-DNA与A-DNA的区别,糖环折叠方式不同,呋喃糖环非平面，,A,：,C3,内；,B,：,C2,内,碱基对倾角和位移（碱基对至螺旋轴的距离）不同,A,：碱基对倾角大、偏向螺旋轴边缘、大沟深小沟浅；,B,碱基对倾角小、螺旋轴穿过碱基对、大小沟同深,糖环折叠,突出原子与5-C在一侧内,突出原子与5-C在异侧外,A-DNA,B-DNA,Z-DNA,1979,年美国,Alexander Rich,等人（,at MIT,）发现了左手,DNA,双螺旋结构,Z,型,DNA,易形成,Z,型结构的碱基序列：,d(Cp,Gp,Cp,Gp,Cp,Gp,),1981 Rich,：,anti-Z-DNA,果蝇唾液腺染色体,天然,DNA,左旋状态,某些植物细胞核、人类胎儿球蛋白基因,Z-DNA,ZDNA,存在的条件,Pu,Py,相间排列,Z-DNA,比,B-DNA,不稳定，体外,高盐：,NaCl,2mol/L,MgCl,2,0.7 mol/L,Z-DNA,结合蛋白，形成局部高盐浓度和微环境。,负超螺旋的存在,左旋,Z-DNA,减低负超转绕的扭力。,5-,甲基胞嘧啶（,m5,C,）,甲基周围局部的疏水区，低盐浓度下可产生,Z-DNA,。,乙酰氨基芴,（,AFF,，致癌物,）促进,Z-DNA,生成。,多胺化合物，与磷酸基因结合，使,B-DNA,转变成,Z-DNA,。,Z-DNA生物学意义,可能与基因表达调控相关,:,出现于基因,5,端调控区,人类肌动蛋白基因；促进染色体重构；甲基化区域,基因抑制作用,病毒等微生物侵染宿主识别区：痘病毒蛋白,E3L,结合,Z-DNA,干扰宿主防御系统,治疗靶点,在,SV40,的增强子中有三段,8bp,的,Z-DNA,存在。,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,B-DNA、A-DNA是DNA的基本构象，Z-DNA为特殊构象,DNA结构改变反应了分子中3个部分的协调变化,磷酸-戊糖主链中单键的旋转,*,脱氧核糖5元环的折叠：,与C-5同侧内；异侧外,碱基对（脱氧）核糖的取向,*,A-DNA,B-DNA,Z-DNA,Z-DNA的顺式鸟嘌呤核苷,A、B型DNA糖苷键构象均为反式；Z-DNA中嘧啶反式，而嘌呤为正式,B型与Z型DNA中的脱氧鸟苷,5.特殊的二级结构,十字型结构（,cruciform structure,）,三链,DNA,结构（,triplex DNA structure,）,脱链,DNA,（,slipped-strand DNA,，,S-DNA,）,DNA,解旋元件（,DNA unwinding elements,，,DUEs,）,十字型结构,回文结构,（palindromic structure）也称,反向重复,（inverted repeats）：从任何一条链的5,3方向碱基序列相同的DNA序列链内互补（,落鹤岛上岛落鹤，垂柳岸边岸柳垂）,发夹形和十字形结构,液相原子显微镜下的十字型结构,十字结构只在低盐条件下维持,磷酸根间斥力,生理盐溶液,X,型结构,真核细胞中，反向重复序列通常靠近基因调控区,三链DNA结构,镜象重复（mirror repeat）,H-DNA三螺旋DNA,液相原子显微镜下的三链结构,Hoogsteen碱基配对,三链DNA的碱基配对形式,双链DNA的碱基配对形式,三链,DNA,可在一条双链和第三条寡核苷酸链间形成,三链也可在超螺旋,DNA,分子内嘌呤,-,嘧啶镜像重复序列之间形成,人类基因组中，大约每,50000bp,出现一次可形成三链的序列；,E.coli,中很少上述序列,脱链DNA（slipped-strand DNA，S-DNA）,DNA区域内几个核苷酸片段多次重复，可能以“滑脱”的方式配对,DNA解旋元件（DNA unwinding elements，DUEs）,30-100bp富含AT,扭曲力作用下，AT区双螺旋松弛,6.DNA可变构象的生物学功能,DNA,结合蛋白作用部位,超螺旋调控：出现于基因调控区，在超螺旋结构特定部位形成,导致部分超螺旋松弛,核小体排除：核小体的形成与十字结构、,H-DNA,、,Z-DNA,等相斥,DNA,序列暴露,分子开关：超螺旋化导致双螺旋上距离远的部位彼此靠近,同源重组、启动子、增强子相互作用,7.DNA超螺旋（superhelix/supercoiling）,DNA双螺旋链再盘绕/螺旋即形成超螺旋结构。,DNA的拓扑学(topology)结构,噬菌体,T,2,DNA,长约,50m,E-coli DNA,长约,1mm,人生殖细胞,DNA,长约,1m,细胞核最小不足,1m,，植物,14m,，动物为,10m,左右。,拓扑学（topology）:,拓扑学用于研究一种物体在不断变形情况下的某些不变的性质。如：一个闭合环形DNA分子在不切断DNA主链的情况下，不管这个DNA分子怎样变形或弯曲，它的拓扑学性质是不变的。,细胞内DNA以超螺旋形式存在,超螺旋结构,环形DNA的超螺旋结构,DNA复制或转录过程中可能涉及超螺旋,真核细胞染色体DNA包装好象是一次缠绕再接一次更高级的缠绕（超螺旋的超螺旋）。,意义,细胞内DNA都是以超螺旋形式存在的，超螺旋是DNA三级结构的重要特征。,DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,关于超螺旋结构的基本概念,超螺旋DNA,DNA是以双螺旋的形式围绕着同一个轴缠绕的。当双螺旋DNA的这个,轴再弯曲缠绕,时，DNA就处于超螺旋状态，DNA超螺旋状态是结构张力的表现，即,双螺旋的螺旋,。,大多数细胞内DNA处于欠旋状态,闭环,DNA,（,closed-circular DNA,）分子接近,B,型结构时（,10.5bp/,圈）为松弛状态。,生物学来源的闭环,DNA,通常为非松弛状态。,细胞调节的张力诱导,DNA,超螺旋,闭环,DNA,通常处于欠旋状态,欠旋引起张力的缓解方式形成超螺旋；易于引起DNA链间的分离,形成超螺旋,约10bp双链分离,84bp,欠旋有利于维持十字形结构、形成Z-DNA,连系数（连环数 linking number L，Lk）,一个闭合环形DNA分子的连系数，严格地等于没有任何超螺旋情况的DNA两条链以右手方向相互缠绕的次数。连系数具有拓扑学性质，是个整数。不管一闭合环形DNA分子如何缠绕或变形，只要两条DNA链不被切开，它的值不变。右手螺旋，连系数定义为正值（+），左手螺旋，连系数定义为负值（-）。,Lk与,比连系差,Lk,Lk,Lk,0,=(,Lk,Lk,0,)/Lk,0,=,Lk,/,Lk,0,Lk,0,为,DNA,分子处于松弛状态时连系数，,Lk,0,=,碱基对数,/10(,每圈碱基对数,),，,Lk,为实际连系数。,值也称超螺旋密度，用于比较不同长度,DNA,分子的超螺旋程度,拓扑异构体：同一分子，,L,值不同；欠旋与过渡缠绕互为镜像,2100bp,=-0.1,L的含义,负超螺旋与正超螺旋,负超螺旋,：由螺旋不足（,Lk,Lk,0,，,Lk,0,，,0,）所导致的超螺旋称正超螺旋（左手螺旋）。,螺旋数与超螺旋数,螺旋数,（,twist,T,）,:,可近似地看成,DNA,双链的,相互缠绕数。螺旋,扭转数number of helical turn,）,超螺旋数,/,盘绕数,（,writhe,W,）：可近似地看成是螺旋轴的缠绕数。,连系数、螺旋数、超螺旋数 三者的关系可用下式,表示：,L=T+W,无盘绕，大扭转,大盘绕，小扭转,T,与,W,值可以是小数，但,L,值必须是整数。,L,值相同的,DNA,之间可以不经链的断裂而相互转变。,T,与,W,两项值不具有拓扑学性质，因为它们在一个闭合环形,DNA,分子的变形中可以改变。,DNA超螺旋结构的形成（DNA拓扑异构酶）,DNA拓扑异构酶：,在每个细胞内含有一些专门使DNA超螺旋或松弛DNA超螺旋的酶类，这些增加或减少DNA超螺旋程度的酶，或者说能改变DNA分子拓扑连系数的酶叫做DNA拓扑异构酶。DNA拓扑异构酶主要分两大类，I 型和II 型。在DNA复制、折叠中发挥重要作用。,I,型酶：,临时性地切开双链,DNA,中的一条链，使切口的一端围绕未切割链旋转一圈，并重新连接切口。这类,DNA,拓扑酶每次作用改变,DNA,分子的拓扑连系数为,1,。,II,型酶：,二型,DNA,拓扑异构酶同时切开,DNA,的两条链，一次作用改变,DNA,分子的拓扑连系数为,2,。,I类和II类酶的综合活性决定细菌DNA超螺旋程度,大肠杆菌中至少存在4种（IIV）拓扑异构酶：,I,类（拓扑异构酶,I,、,III,）,去除负超螺旋松弛,DNA,拓扑异构酶,II,（,DNA,促旋酶）为,II,类拓扑酶，利用,ATP,提供的能量引入负超螺旋,真核细胞亦含,I,类和,II,类拓扑异构酶：,I,类：酶,I,、酶,III,II,类：,II,、,II,松弛正、负超螺旋；不引入负超螺旋,拓扑异构酶I的作用,大肠杆菌拓扑异构酶II（DNA促旋酶）的作用,酶结合于DNA,DNA分子中2区域在结合复合体中以特定构象重叠正结节、负结节,一片段双链断裂，另一片段穿过断口,2负结节,拓扑异构酶催化的连系数变化,图中所有DNA具有相同碱基数，但超螺旋程度不同。,-,+,8.DNA在真核生物细胞核内的组装,核小体是染色质的基本结构,真核生物染色体由,DNA,和蛋白质构成，其基本单位是,核小体,(,nucleosome,),。,核小体的组成,:,DNA,：约,200bp,组蛋白：,H1,，,H2A,，,H2B,，,H3,，,H4,组蛋白是和染色体相联的最主要的蛋白质,组蛋白是比较小的碱性蛋白，富含,Lys,和,Arg,；,在细胞正常,pH,值时，组蛋白带有正电荷，可以和,DNA,结合，在,DNA,组装中起重要作用，保守；,组蛋白的总重量和,DNA,的总重量大致相等；,组蛋白的修饰作用有磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、,ADP-,核糖基化等。,表观遗传学,组蛋白的甲基化修饰,组蛋白甲基化修饰参与异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控等多种主要生理功能，,组蛋白甲基化的异常与肿瘤发生等多种人类疾病相关，可以特异性地激活或者抑制基因的转录活性。,甲基化位点：赖氨酸和精氨酸,核小体组蛋白的乙酰化和脱乙酰化,组蛋白乙酰基转移酶(HAT)：,胞质（B型），核（A）型,乙酰化部位：,Lys,作用：,降低核小体对DNA的亲和力；阻止或促进核小体与其他转录或调节蛋白的相互作用,脱乙酰化：,染色质恢复无转录活性状态，基因沉默,组蛋白八聚体的组装,H1,核心颗粒：,DNA:146bp,组蛋白：2x(H,2,A,H,2,B,H,3,H,4,),连接部：DNA 54bp,组蛋白H,1,串珠状核小体电子显微镜图,核小体在DNA上的定位是动态的,DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体时压缩双螺旋中小沟，富含AT小沟较富含GC小沟易于压缩,一些与DNA紧密结合的蛋白可能影响核小体在DNA上的定位,细胞需要时，核小体的定位可迅速发生变化,核小体包装的高级形式,30nm核小体纤维是核小体的高级组装,双螺旋DNA,染色质形式：,核小体链,螺线管：,(每圈6个核小,体)，30 nm 核小体纤维,突环：,与核骨架相连。,玫瑰花结：,（18环，30,梅花结为一个螺旋圈）,染色体：,每个染色单体,含10个螺旋圈,三、RNA的高级结构,1.RNA分子构象的多样性,2.tRNA的高级结构,tRNA,一般含有,73-94,核苷酸，单链,20,左右位置上为保守核苷酸,含,10,20%,稀有碱基,/修饰碱基,3,末端为,CCA-OH,；,5,末端大多数为,G,，少数为,C,tRNA,二级结构为典型的发卡结构，互补链相接近形成双螺旋区，在氢键的作用下，分子呈三叶草形。,链内碱基配对：,A-U,、,G-C,、,G-U,tRNA的二级结构三叶草形,tRNA的三级结构 倒L形,3.rRNA的高级结构,原核生物,5S rRNA,23S rRNA,16S rRNA,真核生物,5S rRNA,28S rRNA,5.8S rRNA,18S rRNA,rRNA均有其基本的特点,G-C,碱基对与,A-U,碱基对的总量不等,;,单股,rRNA,链可自行折叠，形成螺旋区和环区，所有螺旋区的碱基都是保守的,;,所有来源,rRNA,均能形成,4,个结构域（,、,、,和,），结构域均含许多茎、环，它们通过无距离碱基对的相互反应彼此靠近,;,绝大多数的,rRNA,碱基的特异功能尚不清楚。不配对碱基（环区或单股区）可能涉及,rRNA,与其它,RNA,的结合（,16S,的,3,端与,mRNA SD,顺序形成碱基配对。,E.Coli,16S rRNA,古细菌,4.mRNA的二级结构,2006年耶鲁大学研究组发现一个大的、高度保守的RNA motif，这种RNA motif通常存在于极端革兰氏阳性细菌的一种多基因mRNA的一个非编码部分。,重组基因mRNA翻译起始区二级结构,四、,DNA的变性,1.变性的基本概念DNA,分子量不变、氢键破坏、双螺旋部分解体；双螺旋分离成两条,DNA,单链，分子量,2,分化。,温度、,pH,、离子强度、有机试剂等均能导致,DNA,变性。,变性,DNA,粘度降低、沉降系数增加、浮力密度增加、增色效应、旋光度降低、细菌转化活性下降。,沉降系数：,（,sedimentation coefficient,）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或,s=v/2r,。,s,是沉降系数，,是离心转子的角速度（弧度,/,秒），,r,是到旋转中心的距离，,v,是沉降速度。,沉降系数以每单位重力的沉降时间表示,，并且通常为,1,20010,-13,秒范围，,10,-13,这个因子叫做沉降单位,S,，即,1S=10,-13,秒，如血红蛋白的沉降系数约为,410,-13,秒或,4S,。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在,4S,和,40S,之间，核糖体及其亚基在,30S,和,80S,之间。,DNA,的紫外吸收光谱,变性引起紫外吸收值的改变,增色效应：,DNA,变性时其溶液,A,260,增高的现象。,核酸的紫外吸收,由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外光有强烈吸收，最大吸收峰在,260nm,附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定及纯度分析。,紫外吸收法中DNA或RNA的定量,A,260,=1.0相当于:,50,g/ml,双链,DNA,40,g/ml,单链,DNA,（或RNA,）,20,g/ml,寡核苷酸,A,260,/A,280,DNA,纯品,:A,260,/A,280,=1.8,RNA,纯品,:A,260,/A,280,=2.0,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂及碱基堆积力的破坏,DNA的降解,在温度、pH急剧变化，或在酶、超声波、高速搅拌、电离辐射的作用下，DNA二级结构遭到破坏，同时维系DNA一级结构的共价键也被切断，DNA分子量发生变化的过程。,理化性质:紫外吸收 粘度,高于Tm值5,退火,（annealing）,生物活性得到部分恢复,2.变性DNA在一定条件下可以复性,淬火,DNA复性动力学,DNA 复性过程基本上符合,二级反应,动力学，其中第一步为慢反应,，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对的部分，首先形成双螺旋。,第二步为快反应,，尚未配对的其他部分碱基配对相结合，象拉锁链一样迅速形成双螺旋。,复性反应：,S：single strand DNA,D：double strand DNA,完全变性DNA的复性反应可表示为：,经重排，积分得：,c,c,0,1+kc,0,t,=,1,c,0,：t=0时，起始DNA的浓度（mol/L）,c：t时间时，单链DNA的浓度（mol/L）,k：复性反应常数（L/molsec）,t：复性时间（sec）,DNA,复性反应的初始浓度,c,o,与反应完成一半所需时间的乘积为常数。在一定条件下，复性反应的速度可以用,c,o,t,1/2,来衡量。,实验证明,K,值与复性,DNA,分子量成正比。,c,o,t,1/2,或,K,称,DNA,分子复杂度,(complexity),，,DNA,片段越大复性越慢。,DNA,的浓度越大复性越快。,k,3.温度对DNA变性的影响,任何有机固体物质都有一个特定的熔点,DNA,分子内部也是一个十分规则有序的结构,有特定熔点（,Tm,）。,与有机固体熔解过程相似，在缓慢将,DNA,溶液加热过程中，开始并不出现二级结构变化，直到某一狭窄温度范围，发生螺旋到线团转变。,DNA,熔解。,DNA的熔解温度（melting temprature Tm）,DNA在加热变性时，紫外吸收增加值达总增加值一半时（双螺旋结构失去一半时？）的温度称为该DNA的,变性温度,，也称,熔点,或,熔解温度,，用,Tm,表示。DNA的Tm值一般在 8295 度之间，每种DNA都有一个特征性的Tm值。,解链曲线,如果在连续加热DNA的过程中以温度对A,260,值作图，所得的曲线称为解链曲线,。,影响Tm值的因素,DNA,的均一性：,均质,DNA Tm,值范围较窄，异质,DNA Tm,值的范围较宽,DNA,中,G-C,对的含量,经验式,:(G+C)%=(Tm-69.3)2.44,盐离子强度：,离子强度低的介质中，,Tm,值较低范围较宽；离子强度较高的介质中，,Tm,值较高，范围较窄DNA,在含盐缓冲液中保存）,G-C含量对Tm值的影响,肺炎球菌,粘质沙雷菌,盐浓度对Tm值的影响,4.pH对DNA变性的影响,介质中,pH,的改变可导致,DNA,变性,25,，,0.05mol/L,NaCl,溶液中，从中性到,pH4.5,左右，约发生,10%,的,DNA,可逆变性。,pH3,以下、,pH12,以上为不可逆变性。,通常介质中,pH,在,5.5-8.5,范围内，,DNA Tm,值变化不大。,pH 12,酮基 ,烯醇基,pH 2-3,NH,2,NH,2,+,(质子化),改变氢键的形成与结合力,极端pH条件的影响,一切减弱氢键、碱基堆积力的因素,均将使,Tm,值降低,碱基因pH不同采取同分异构形式,酮式,烯醇式,鸟嘌呤,内酰胺,双内酰亚胺,尿嘧啶,DNA双链中碱基间在氨基氢和羰基氧之间形成氢键,5.碱基组成对DNA变性的影响,中性,pH,条件下，,GC,对增加，,DNA,热稳定性增加。,0.15mol/L,NaCl,和,0.015mol/L,柠檬酸钠溶液中，,G+C,含量每增加,0.01mol/L,，,DNA Tm,值增加,0.41,。,DNA,热稳定性还与碱基的排布有关，多个,G,或,C,连续排列,抗热核心。,增色效应的跳跃现象(Jump of Hyperchromicity),高分子量的DNA分子在热变性过程中,富含AT区域首先发生 变性,然后逐步扩展,表现增色效应的跳跃现象。变性加快。,rich AT,rich AT,6.,离子强度对DNA变性的影响,单链DNA主链的磷酸基团,负电荷的静电斥力,两条单链DNA的分离,Na,+,在磷酸基团周围形成的电子云,对静电斥力产生屏蔽作用,减弱静电斥力,7.有机溶剂对DNA变性的影响,许多有机溶剂可导致,DNA,变性,酰胺、脲、氨基甲酸酯、醇类等促使,DNA,变性，与,DNA,中,GC,含量、介质离子强度、变性剂浓度、,DNA,浓度有关。,有机溶剂变性机制,有机溶剂存在，离子溶剂化能力低，难于中和,DNA,分子负电荷；,有机溶剂具疏水性，稳定因变性暴露的疏水基团；,尿素，酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键，,Tm,值可降至,40,左右,8.其他理化因素对DNA变性的影响,紫外线、,X,射线、荧光染料,DNA,分子化学损伤局部变性,Tm,值降低。,羟基胺破坏,DNA,分子中胞嘧啶残基，降低,Tm,。,二胺、多胺、精胺与,DNA,磷酸基团相互作用，中和负电荷,DNA,稳定。,紫外线和一些化学因子、烷化剂对DNA的损伤,亚硝酸,烷化剂：乙基甲烷磺酸（EMS）,紫外线诱导胸腺嘧啶二聚体,与嵌合剂的反应,溴乙啶,丫啶橙,放线菌素D,