选修3.1DNA重组技术的基本工具.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程,专题1,烟草,据,WTO,调查：,2004,年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人,中国卫生部通报：,2004,年,月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。,发病死亡率近100%,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因,每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将,人的胰岛素基因,重组到,大肠杆菌,内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：,2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000,万。,胰岛素,思考,：,转基因技术,实现了,一种生物,的某些,性状,在,另一种生物,中,表达,。,这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,DNA(基因)mRNA 蛋白质(性状),转录,翻译,通用,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,基因工程的产物,什么叫基因工程？,基因工程，又叫,DNA重组技术,。是指,按照人们的愿望,，在DNA,分子水平,上进行严格的,设计,，并通过,体外,DNA,重组和转基因技术,，赋予生物以,新的遗传特性,，从而创造出更符合人们需要的新的,生物类型,和,生物产品,。,基因工程的概念,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔,提出基因的,分离定律,和,自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根,证明,基因在染色体上,，并提出基因的,连锁互换定律,。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里,证明,DNA是遗传物质,，DNA可从一种生物个体,转移,到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森,、,克里克,提出DNA的,双螺旋结构,模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松,、,斯塔尔,证明DNA的,半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克,等提出,中心法则,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年,尼伦伯格,和,马太,破译编码氨基酸的,遗传密码,，1966年,霍拉纳,用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现,2)工具酶的发现,3)DNA合成和测序技术的发明,4)DNA体外重组的实现,5)重组DNA表达实验的成功,6)第一例转基因动物问世,7)PCR技术的发明,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。,想一想,需要做哪些关键工作？,苏云金芽孢杆菌,毒蛋白,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花,(,无抗虫特性,),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含,抗虫基因,转基因棉花产生,伴胞晶体,转基因棉花有,抗虫特性,一、DNA重组技术的基本工具,培育转基因抗虫棉的关键步骤：,1.ONE,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌,提取出来,2.TWO,抗虫基因与运载体DNA连接,3.THREE,抗虫基因导入受体(棉花)细胞,基因的“剪刀”,基因的“针线”,基因的运载体,一,、“分子手术刀”,二,、“分子缝合针”,三,、“分子运输车”,Go on,转基因,思考：,自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？,动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？,为什么？植物呢？,单细胞生物，容易遭到入侵吗？,单细胞生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？,可能酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源：,种类与命名：,作用特点：,作用结果：,原核生物,阅读“分子的手术刀”1min,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源：种类与命名：,作用特点：,4.,限制酶识别序列,5.,作用结果：,识别,特定核苷酸序列,原核生物,产生黏性末端或平末端,切断,磷酸二酯键,具有,特异性,。,一种,限制酶,只能识别一种,特定的,核苷酸序列,，并且能在,特定的切点,上切割DNA分子,大多数,限制酶的识别序列由,6个,核苷酸组成,少数的,识别序列由,4、5或8个,核苷酸组成,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,E,co,R,S,ma,粘质沙雷氏杆菌,（,Serratia,marcesens,）,大肠杆菌,（,Escherichia,coli,R,）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,属名,种名,菌株(品系),大肠杆菌,R,型菌株分离出的第一个限制酶,Escherichia,coli,R,E,co,R,种名前两字母,(小写、斜体),菌株 (品系),罗马数字区分同一菌株分离出的不同酶,例：流感嗜血杆菌(,Haemophilus influenzae,)d,株系中第二种限制酶的命名：,Hind,II,粘质沙雷氏,菌(,Serratia marcescens sb,)中第一种限制酶的命名：,Sma,限制酶的命名,属名首字母,(大写、斜体),Go back,T,磷酸二酯键,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,A,3.作用特点：,切割部位：,脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架,Go back,磷,酸,二,酯,键,3.作用特点：,4.,限制酶的识别序列：,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条,中心轴线,（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是,反向、对称、重复,排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,Go back,大多数,限制酶的识别序列由,6个,核苷酸组成,少数的,识别序列由,4、5或8个,核苷酸组成,Sma,平末端平末端,5.作用结果,EcoR,黏性末端,黏性末端,5.作用结果,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,重复演示,5.作用结果,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵,，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。,限制酶,就是细菌的一种,防御性工具,，当外源DNA侵入时，会利用限制酶,将外源DNA切割,掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、,使之失效,，从而达到,保护自身,的目的。,CTTCATG AATTCCCTAA,GAAGTACTTAA GGGATT,GGCATCTTAA,AATTCCGTAG,练习使用EcoRI 剪切目的基因,CTTCATG AATTCCCTAA,GAAGTACTTAA GGGATT,GGCATCTTAA,AATTCCGTAG,目的基因,黏性末端,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性,(,平,),末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生,相同的黏性(平)末端,，然后让两者的黏性(平)末端,黏合,起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,Go back,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoR,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,酶切,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将,脱氧核糖和磷酸,连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,可把黏性末端之间的,缝隙“缝合”,起来，,Ecoli DNA连接酶或T,4,DNA连接酶,即,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T,4,DNA连接酶,还可把,平末端之间的缝隙“缝合”,起来，但效率较低,T,4,DNA连接酶,DNA连接酶的作用过程,点击播放,类型：,类型,Ecoli,DNA连接酶,T,4,DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T,4,噬菌体,恢复,磷酸,二酯键,只能连接,黏性末端,能连接,黏性末端,和,平末端,(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,区别1,区别2,相同点,寻根问底,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶是一回事吗,?,为什么,?,1)只能将,单个核苷酸,连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成,磷酸二酯键,1)在,两个DNA片段之间,形成磷酸二酯键,2)以,一条DNA链为模板,，,将,单个核苷酸,通过磷酸二酯键,连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的,两个缺口同时连接,起来，,不需要模板,Go on,模拟制作：,用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用胶纸模拟基因种间连接。,棉花的一段,DNA,含毒蛋白基因的细菌DNA片段,Go back,（三）“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：,有1,多个限制酶切点,对受体细胞无害,导入基因,能在受体细胞中复制、表达,有某些标记基因，便于筛选,常用运载体：,细菌的质粒,噬菌体或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,议一议,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、,假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链,DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,Go on,答：,2,和,7,能连接形成ACGT,TGCA；,4,和,8,能连接形成GAATTC,CTTAAG；,3,和,6,能连接形成GCGC,CGCG；,1,和,5,能连接形成CTGCAG,GACGTC。,思考与探究 P7,思考与探究 P7,1、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者,不具备,这种限制酶的,识别切割序列,，或者通过甲基化酶,将甲基转移,到所,识别序列,的碱基上，使,限制酶不能将其切开,。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示：,基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。,是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？,不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1）载体DNA必需有,一个或多个限制酶,的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是,在质粒本身需要的基因片段之外,，这样才不至于因目的基因的插入而失活。,2）载体DNA必需具备,自我复制的能力,，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的,复制而同步复制,。,3）载体DNA必需,带有标记基因,，以便重组后进行重组子的筛选。,4）载体DNA必需,是安全的,，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。,5）载体DNA分子,大小应适合,，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,3、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都,不具有,连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么,？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,对照组：,不添加,抗生素,实验组1：添加一定浓度的,四环素,实验组2：添加一定浓度的,氨苄青霉素,实验组3：添加一定浓度的,四环素,和,氨苄青霉素,练习,对照组,实验组1,实验组2,实验组3,结 论,预期一,预期二,预期三,预期四,对照组：,不添加,抗生素,实验组1：添加一定浓度的,四环素,实验组2：添加一定浓度的,氨苄青霉素,实验组3：添加一定浓度的,四环素,和,氨苄青霉素,既,含有抗四环素基因,也,含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既,不含有,抗四环素基因也,不含有,抗氨苄青霉素基因,什么是内含子和外显子？,原核细胞基因,的编码区是,连续,的，,真核细胞基因,的编码区是,间隔的、不连续的,.,真核生物基因的结构特点是：“编码区是间隔的、不连续的。”也就是说：能够编码蛋白质的序列被不能编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，,能够编码蛋白质的序列叫外显子，不能编码蛋白质的序列叫内含子。,真核基因包括编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子,内含子不翻译蛋白质。,知识拓展,什么是内含子和外显子？,在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为,外显子,。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为,内含子,。,内含子（Intervening region）是一个基因中非编码DNA片断，它分开相邻的外显子。更精确的定义是：内含子是阻断基因线性表达的序列。DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行转译前被剪除。,在成熟mRNA被保留下来的基因部分被称为外显子。,真核生物的基因含有外显子和内含子，是前者区别原核生物的特征之一。,知识拓展,知识拓展,关于内含子和外显子的说法正确的是（）,A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成熟的mRNAB.只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNAC.原核细胞基因中也有内含子和外显子D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区,知识拓展,B,Go back,