分子生物学研究法下.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,扉页：,当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。,5.4 SNP的理论与应用,SNP,的定义,定义：单核苷酸多态性(,single nucleotide polymorphism,，,SNP),主要是指在基因组,DNA,序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。,是第三代遗传标记。,5.4.1 SNP概述,单倍型：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。,SNP分类：cSNP 同义cSNP,非同义cSNP,pSNP,rSNP,基因调控区,SNP,基因间随机非编码区,SNP,基因编码区,SNP,5.4.2 SNPs经典检测方法,一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如,:,1.,限制性片段长度多态性法,PCR-RFLP;,2.,单链构象多态性法,PCR-SSCP;,3.,变性梯度凝胶电泳,(denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE);,4.,等位基因特异性,PCR(allele specific PCR,ASPCR),等等,PCR-RFLP方法,原理：,利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，,用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一,DNA,片,断，如果存在,SNP,位点，酶切片断的长度和数量则会,出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否,SNP,位,点。,特点：,该技术应用的前提是,SNP,的位点必须含有该,限制内切酶的识别位点，它是,SNP,筛查中最经典的,方法之一,.,单链构象多态性(SSCP),原理：,单链,DNA,在中性条件下会形成二级结构，不同的,二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖,于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导,致在凝胶上迁移速度的改变。,在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链,DNA,和,RNA,分,子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上,的迁移速率不同，出现不同的条带，检测,SNP,。,特点：,由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,变性梯度凝胶电泳（DGGE）,原理：,是利用长度相同的双链,DNA,片段解链温,度不同的原理,通过梯度变性胶将,DNA,片段分开,的电泳技术。,电泳开始时,DNA,在胶中的迁移速率仅与分,子大小有关,而一旦,DNA,泳动到某一点时,即到,达该,DNA,变性浓度位置时,使得,DNA,双链开始,分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电,场力平衡时,DNA,片段在凝胶中基本停止迁移。,由于不同的,DNA,片段的碱基组成有差异,使得其,变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条,带。,等位基因特异 PCR(AS-PCR),原理：,根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特,异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS,-,PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引,物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没,有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增,产物的有无,从而确定基因型的 SNP。,5.4.3 SNPs,高通量的检测方法,另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通,量、自动化程度较高的检测,SNPs,的方法,较为常用,的有,:,1.DNA,测序法,;,2.DNA,芯片检测,;,3.,飞行质谱仪,(MALDI-TOFMS),检测,;,4.,变性高效液相色谱,(DHPLC),法等等,DNA测序法,直接测序是最容易实施的,SNP,检测方法。,原理,:,通过对不同个体同一基因或基因片段进行测,序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检,出率可达,100%,。,特点：,可以得到,SNP,的类型及其准确位置等,SNP,分,型所需要的重要参数。,基因芯片技术(Genechips),原理,:,是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。,特点：,基因芯片具有信息量大和自动化程度高的,突出优点。但它也存在若干问题:芯片造价高昂,所,需设备贵重,不利于普及应用。,MALDI-TOF,原理：,是将变性的单链,PCR,产物通过与硅芯片上,的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基,不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基,的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测,SNP,。,变性高效液相色谱(DHPLC),原理：,目标核酸片段,PCR,扩增，部分加热变性后，含有突变,碱基的,DNA,序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异,源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同,源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。,SNPs,的有无最终表现为色谱峰的峰,形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的,碱基。,特点：,使用高效液相色谱检测,SNPs,具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知,SNPs,的准确率可达,95%,以上。但,DHPLC,检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。,SNP,及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（,High Resolution Melting,）,High Resolution DNA Melting,（,HRM),是基于有序列变化的,Amplicon,之间微弱的,Tm,值差异，通过,DNA,片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：,5.4.4 SNP的应用,1.,人类基因单体型图的绘制,2.SNP,与疾病易感基因的相关性分析,3.,指导用药与药物设计,Gene,SNP by bioinformatics,真核生物基因组庞大，含有大量重复序列。无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法，都难以直接分离到目的基因片段。,尽管高等生物一般具有,3-5,万种左右不同的基因，在单个细胞或组织的特定时间段中，仅有,15-20%,左右的基因得以表达。,5.5,基因克隆技术,cDNA,克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总,poly,（,A,）,mRNA,转变成双链,cDNA,群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的,cDNA,基因文库。,基因工程基本步骤,目的,DNA,制备；载体,DNA,选择,DNA,体外重组技术 （,DNA,酶切实验、连接实验）重组,DNA,的转化（转染）试验,重组克隆的筛选与鉴定,（重组体的表型筛选，,指纹图谱法，,PCR,方法，探针杂交法）目的基因表达产物的筛选与鉴定（,遗传互补法，免疫化学法,Western,印杂交法，,微细胞法,(microcell method),基因工程流程示意图,5.5.1,RACE(cDNA,末端快速扩增,),是用于从已知,cDNA,片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行,PCR,扩增得到目的序列。用于扩增,5,端的方法称为,5RACE,，用于扩增,3,端的称为,3RACE,。,5RACE,1.,在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始,cDNA,第一条链的合成,2.RNase,混合物降解模板,mRNA,，纯化,cDNA,第一条链。,3.,用末端转移酶在,cDNA,链,3,端加入连续的,dCTP,4.,以连有,oligo(dG),的锚定引,物和基因片段内部特异的,nested,引物进行,PCR,扩增，以期得到目的片段，并可用,nest PCR,进行检测。,3RACE,1.,在反转录酶的作用下，以连,有可以和,polyA,配对的,oligo(dT),的锚定引物启始,cDNA,第一条链的合成。,2.,用,RNaseH,降解模板,mRNA,。,3.,用通用锚定引物和基因片段,内部特异引物进行,PCR,扩增得到目的,3,片段，并可用,nest PCR,的方法继续进行检测和扩增。,5.5.2,应用,cDNA,差示分析法克隆基因,该法通过降低,cDNA,群体复杂性和更换,cDNA,两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为,Tester,和,Driver,在接受差示分析前均经一个,4,碱基切割酶处理，形成平均长度,256bp,的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。,每次T,减,D,反应后仅设置,72,复性与延伸，,94,变性这两个参数共,20,个,PCR,循环，,PCR,产物的特异性和所得探针的纯度非常高。,RDA流程图。,5.5.3 TA,载体,Topo TA,载体,Invitrogen Proprietary&Confidential,37,Different ways to generate the entry clone,TOPO Cloning,TOPO,BP Clonase,BP Cloning,PCR Product,+,TOPO-Activated,Entry Vector,L1,L2,Gene,+,attB,PCR Product,B2,Gene,B1,Donor Vector,P2,ccdB,P1,Entry Clone,L2,Gene,L1,+,digested DNA Fragment,Gene,B1,digested Entry Vector,L2,L1,4.Pre-made entry clone,5.Custom-made entry clone,Ligase,Restriction/Ligase Cloning,ORF Collection,L2,ORF,L1,MultiSite Gateway-Extending the applications,Your Application,Gene1,Gene2,Gene3,Gene4,Your Application,Gene,Protein,Localization,Gene,Gene,Protein,Purification,Gene,RNAi,Gene,Cell-Free,Gene,Protein,interaction,Gene,Gene,Entry Clone,PCR,Gene,synthesis,ORF,collection,Library,Your,Source,Gateway,大规模克隆技术,大量的基因组序列被测定，要阐明这些基因的功能需要将不同的可译框架连入载体，传统的方法不能满足大规模克隆的需要。,Gateway,基因大规模克隆法：利用噬菌体进行位点特异性,DNA,片段重组，实现了基因快速克隆和载体间平行转移。,Gateway,克隆技术主要包括：,TOPO,反应和,LR,反应,TOPO,反应：将目的基因,PCR,产物连入,Entry,载体；,LR,反应：被用于将目的片段从,Entry,载体中重组入表达载体。,Entry,载体上的,CCCTT,被拓扑异构酶识别，切开后通过,274,位酪氨酸与切口处的磷酸基团形成共价键，加入,PCR,产物后，形成的,3,突出端,GTGG,攻击,PCR,产物的互补性末端并与接头序列,CACC,退火，切去,GTGG,后使,PCR,产物以正确方向连入,Entry,载体,5.5.4,基因的图位克隆（,Map-based cloning,）,所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的,RFLP,或,RAPD,分子标记。,通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的,RFLP,标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。,图,5-25,染色体步移法克隆基因示意图,5.6,蛋白质组与蛋白质组学技术,1995,年，首次发表关于蛋白质组学（,proteome,）概念的论文。,蛋白质组是指一个基因组所表达的全部蛋白质,蛋白质组学是指在蛋白质组水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译与修饰、蛋白与蛋白相互作用等，并由此获得相关疾病发生、发展及细胞代谢等过程的整体认识,5.6.1,双向电泳技术,5.6.2,蛋白质印迹法,5.6.3,蛋白质的质谱分析技术,5.6.1,双向电泳技术,等电聚焦电泳（,Isoelectric focusing,IFE,）,利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个,pH,梯度。,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）,在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。,依赖于蛋白质的两个性质：等电点和相对分子质量,当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的,pI,相一致的,pH,处，具有不同,pI,的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的,pH,处，达到分离的目的。,蛋白质分子与,SDS,充分结合后，,SDS,负电荷掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。这样的蛋白质,-SDS,复合物在,SDS,聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率主要取决于蛋白质分子量大小。,如果将等电聚焦电泳与,SDS-PAGE,结合起来，就是分辨率更高的双向电泳。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在,pI,上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。,5.6.2,蛋白质印迹法,蛋白质印迹法（,Western bloting,），又称免疫印迹法（,immunoblotling,）,原理：据被测蛋白能与特异性抗体结合的特性和该蛋白的相对分子质量。,特点：高效、简便、灵活等,蛋白质样品,电泳,非标记抗体（一抗）发生免疫反应,荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反应,通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分,转膜,（硝酸纤维素薄膜）,方法：,图,5,28,免疫印迹法示意图,封闭,影响免疫印迹法成败的因素：,主要因素是：抗原分子中可被抗体识别的表位信息。,第二个因素：蛋白原液中抗原的浓度,用于检测的二级抗体一般分为以下三种,1.,放射性标记的抗体,2.,与酶偶联的抗体：,主要包括：辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,3.,与生物素相偶联的抗体,western blot,实验步骤视频,质谱基础,样品,离子源,质量分析器,离子检测器,固体,液体,蒸汽,形成离子,(,带电分子,),电离,质量分选,(,过滤,),检测,根据,m/z,分选离子,数据处理,质谱,检测离子,基本步骤,:,1.,样品离子化,2.,根据质量,(m/z),不同分离离子,3.,检测每种质量离子的数目,4.,收集、处理数据得到质谱图,质谱的评价指标,质量范围,速度,灵敏度,分辨率,精确度,+,+,+,自由漂移区,检测器,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,(MALDI-TOF-MS),样品探针,激光,335 nm,m/z,相对强度,MH,+,MH,+,MH,+,特点：,灵敏度高,准确度高,分辨率高,质量范围广,图谱简明,速度快,ESI,四级杆质量分析器,碰撞室,反射器,MCP,检测器,碰撞气体,串联质谱法,(MS/MS),ESI-Q-TOF,质谱仪,步骤：,1,质量分析,2,碰撞,(,离子裂解,),3,质量分析,TOF,质量分析器,强的抗背景干扰能力,极高的检测灵敏度和准确,度,可用来分析复杂混合物中的蛋白质,丰富的检测信息,，,高通量鉴别蛋白质,串联质谱的优点,1,、,鉴定和注释蛋白质的路线,通过肽质谱指纹图（,peptide mass fingerprinting,，,PMF,）和数据库搜寻匹配,通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定,鸟枪法蛋白质组学,1234.5396,783.9147,375.2561,多肽 已测得质 谱数据或理论 质谱 数据,MALDI-TOF,检测的多肽指纹,胰酶消化,凝胶,蛋白质,数据库,?,1,2,3,比较,:,?,是否相同,?,质谱,3235.2256,肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因,样品量太少，,PMF,图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。,2-DE,胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获,PMF,图实际上是两个以上蛋白质的混合图。,操作中角蛋白或其他蛋白质的污染,蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载,所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多,未知的新蛋白质,数据库规模太小,氨基酸序列,VLD,PNT,VFAL,蛋白质数据库,？查询,串联质谱图,从头测序,输入,输出,序列片段,PNT,串联质谱鉴定多肽的计量方法,ELISA实验,immunohistochemistry,谢谢,生化教研室 王青松,wqs92115,