质粒图谱的阅读.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基因工程,（上游）,大体步骤,获取目的基因,目的基因与载体连接,连接产物导入细胞,目的基因表达,逆转录PCR法,PCR法,直接调用法,各种质粒,各种病毒,皆经改造,原核细胞,真核细胞,哺乳动物细胞,植物细胞,1,第一节获得目的基因,2,直接分离目的,DNA,经限制酶切割，电泳分离,DNA,片断。,适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物的基因片段。,真核生物的染色体,DNA,中含有内含子序列，不适合于基因工程的需要。,3,第二节,重组DNA分子的构建,6,Link of cohesive end,粘末端连接,一,.目的基因与载体的连接,7,Link of blunt end,平末端连接,8,平末端连接,Recombinant DNA,T,4,DNA ligase,vector,1,9,平末端连接的缺点,*more difficult ligation 连接困难,*2-direction insertion 双向插入,*self-reconnection 自身环化,*no easy way of retrieving the insert,重新筛选插入的片断困难,10,vector,1,2,vector,1,2,A,A,B,A,B,平齐末端连接时，插入的方向是随机的，称为双向插入。会给后续的工作造成很多麻烦。,11,EcoRI,EcoRI,单酶切粘末端连接,12,单酶切粘末端连接的特点,优点*Using the same one enzyme to cut,用同一种酶切,*Ligated easily and coveniently,连接容易方便,缺点*Self-reconnection of vector,载体自身环化,*Inserted in two directions,双向插入,13,单酶切粘末端的双向插入,G,CTTAA,AATTC,G,AATTC,G,G,CTTAA,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,14,15,AATTC,xxxxxx,AG,xxxxxx,TTCGA,G,AGCTT,CTTAA,A,G,AATTC,xxxxxx,A,AGCTT,CTTAA,G,xxxxxx,TTCGA,A,ligase,双酶切粘末端连接,EcoRI,HindIII,EcoRI,HindIII,16,双酶切粘末端连接的特点,*Using the same two enzymes to cut,*Ligated easily and conveniently,*no self-reconnection of vector,*Inserted in one direction 定向插入,缺点 操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件不同，需要进行两个阶段的反应。,17,几种实验方法,利用相应的技术方法，使实验顺利进行。,18,Link of homopolymeric tails,添加同聚尾避免质粒的自身环化,末端转移酶,19,添加接头，引入限制酶的切割,位点，然后用相应的酶切割。,20,野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统，会切割外源DNA分子。因此用于基因工程的受体菌，需经筛选和人工改造。,第三节 重组子导入细胞,21,外源DNA转入细胞的过程叫做转化。,但不包括由病毒介导的DNA转入。常用的方法有两种：,22,The first is a,chemical method utilizing CaCl,2,and heat shock to promote DNA entry into cells.,氯化钙法：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源 DNA的进入。,23,宿主细胞与重组DNA在0,0,C的氯化钙溶液中孵育，快速转入,42,0,C造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受态细胞。,24,处理宿主细胞,低渗溶液热休克,E.coli,+0.1M CaCl,2,competent(,E.coli,)cells,被转化的宿主细胞,Low-osmosis makes cell expanding,0-4,Recombinant DNA+,42,Heat makes cell more expanding and membrane more permeable,25,处于感受态的细菌表面正电荷增加，细胞膜的结构有改变，通透性增强，转化子易于进入细胞。,26,其他处理受体细胞的方法,利用二甲基亚砜（DMSO）处理细胞,二巯基苏糖醇（DTT）处理细胞。,利用聚乙二醇（PEG）处理细胞。,27,When competent cells are mixed with DNA，some cells(actually,very few)become transformed:they acquire recombinant vector DNA.,Pseudo-positive,positive,28,第四节,重组子的筛选与鉴定,29,After transformation，only a few cells take up the plasmid DNA，and there only has one recombinant molecule in one recipient cell(受体细胞)，so a method is needed for selecting those,转化步骤后，转进重组质粒的细胞是较少的。因此需要挑选出含有重组子的细胞。,30,Direct selection,直接筛选,Antibotic,resistance,抗菌素抗性,Marker rescue selection,借助颜色筛选,In situ hybridization,原位杂交,Immunology selection,免疫筛选,Immunochemistry method,免疫化学,Enzyme,immunodetection,assay,酶免疫分析,31,质粒载体带有氨苄青霉素抗性基因，在宿主细胞内该抗性基因表达出可水解氨苄青霉素的酶，因而宿主细胞可在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长。,利用抗生素抗性筛选,32,复制起点,氨苄青霉素抗性基因,33,34,35,2.利用颜色筛选,插入失活现象,X-gal,：5-溴-4-氯-3-吲哚-,B,-D-半乳糖苷,36,多克隆位点半乳糖苷酶的基因内有多克隆位点，酶切插入外源DNA后，该基因无法表达.,37,38,完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。,当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的,半乳糖苷酶，,该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5溴4氯靛蓝，使得菌落呈现蓝色。,39,表示外源基因插入编码半乳糖苷酶的基因区段,40,Target gene,41,42,蓝色菌落,无插入序列,白色菌落,含插入序列,转化菌具有氨苄青霉素抗性，可在 加有氨苄青霉素的平板上生长。,43,使用含,Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。,1.载体自身环化，产生蓝色菌落；,2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。,3 未转化的细胞，不能生长。,44,45,Blue colonies,represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pVector and express a functional,alpha fragment,from an intact LacZ alpha coding sequence.,White colonies,represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pInsert and do,not,produce LacZ alpha fragment.,46,47,3.In situ hybridization 原位杂交,生长在琼脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝酸纤维素膜上，加入放射性的探针（即带有 放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌落杂交。经洗涤后的膜与X光胶片作用，挑选出阳性克隆。,48,49,DNA hybridization,50,51,52,53,54,免疫法筛选,外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可与特异性的抗体结合。,55,利用抗体筛选,原理,目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌落。,方法,在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该抗体可携带酶或荧光，易于检测。,56,Screening with antibodies,is used when cloned gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein are available.,57,第五节,基因表达产物的鉴定,58,基因表达,基因表达指某基因在细胞中,转录为mRNA继而翻译成蛋白质的过程。,DNA,RNA,Protein,转录,翻译,59,研究基因表达的手段,1、RT-PCR(RNA),2、Northern blot(RNA),3、Western blot(蛋白质）,4、免疫组化（蛋白质）,60,1、RT-PCR,基本原理：,将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA,为模板，进行PCR反应。根据PCR产物的,量，判断基因表达的强度。,mRNA,cDNA,PCR产物,61,2、Northern blot,标记探针与膜固相RNA杂交。,根据杂交信号强弱判断表达量，,根据杂交信号位置判断分子长度。,杂交信号,62,实验操作：,1）RNA提取,2）RNA电泳（分离不同长度RNA),3）转膜(形成固相RNA),4）探针标记（同位素/非同位素）,5）杂交,6）洗膜,7）显影（放射性/酶促反应）,63,Northern,blot,特点：,因为没有扩增过程，Northern blot 的,结果可靠性高。可以确定未知基因的,转录产物（mRNA）长度。,优点：,缺点：,1、操作烦琐,2、使用同位素可能污染环境,3、灵敏度低,4、对RNA质量要求高,64,3、Western blot,标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。,根据信号强弱判断蛋白表达强度。,根据信号位置判断蛋白分子量。,标准分子量,蛋白,特异性反应带,65,1）蛋白提取,2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白）,3）转移,4）封闭,5）一抗作用,6）标记二抗（HRP/AP标记）作用,7）显色,实验操作：,66,Western blot,特点：,优点：,直接检测蛋白质的表达量。,缺点：,灵敏度低,一抗制备难度大，购买价格高,67,氨基酸序列测定,测定N端的1015个氨基酸,测定C端的5个氨基酸,样品需精制,价格较高,68,