原核基因表达调控讲义.ppt

原核基因表达调控,第一节 原核生物基因表达特点,Characteristics of Gene Expression of Prokaryotes,操纵子在研究基因表达的重要性,具有普遍性；,真核生物研究的借鉴；,开拓了分子识别（,molecular recognition),的研究；,研究成果应用于实践，具有指导意义。,一、操纵子是原核生物的基因转录单元,操纵子理论实验依据,实验模型：细菌的乳糖代谢酶类诱导,突破点,:,乳糖阻遏蛋白基因,lac I,的发现,lac I,是组成型表达基因，其突变,(,lac I,-,),引起管辖的基因族也发生组成型表达,用噬菌体转导方法把野生型,(,lac I,+,),转入突变株,(,lac I,-,),，,逆转了组成型突变,蛋白质因子,特异,DNA,序列,结构基因,启动子,操纵序列,阻遏蛋白基因,(promoter),(operator),启动子是,RNA,聚合酶识别和结合的部位。,RNA,转录起始,-35,区,-10,区,TTGACA,TTAACT,TTTACA,TATGAT,TTTACA,TATGTT,TTGATA,TATAAT,CTGACG,TACTGT,N,17,N,16,N,17,N,16,N,16,N,7,N,7,N,6,N,7,N,6,A,A,A,A,A,trp,tRNA,Tyr,lac,rec,A,Ara,BAD,TTGACA,TATAAT,共有序列,操纵序列是阻遏蛋白的结合位点,当操纵序列结合有,阻遏蛋白,时，会阻碍,RNA,聚合酶与启动序列的结合，或是,RNA,聚合酶不能沿,DNA,向前移动，阻碍转录。,启动序列,编码序列,操纵序列,pol,阻遏蛋白,二、原核生物中,mRNA,的转录、翻译和降解偶联进行,三、,mRNA,所携带的信息差别很大,细菌,mRNA,所编码的蛋白质数量有很大差异。有的,mRNA,只带有一个结构基因的信息（编码一个蛋白质），称为,单顺反子,mRNA,（,monocistronic mRNA,）,；,大部分,mRNA,都是从操纵子转录而成，带有编码几个甚至十几个蛋白质的序列信息，这种,mRNA,是从几个首尾相连的结构基因（存在于一个操纵子中）一次转录而成，称为,多顺反子,mRNA,（,polycistronic mRNA,）,。,一、转录调控是以特定的,DNA,序列和蛋白质结构为基础,（一）特定的,DNA,序列是转录起始调控的结构基础,在基因内和基因外都有一些特定的,DNA,序列，与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合，这些特定的,DNA,序列称为,顺式作用元件,（,cis-acting elements,）,，亦称为顺式调控元件。在原核生物中主要是启动子、阻遏蛋白结合位点、正调控蛋白结合位点、增强子等。,转录调控,牵涉到,DNA,和,蛋白质,的作用,基因的转录调控序列或称,顺式作用元件（,cis,-acting element,）,，指与结构基因表达调控相关，能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的,DNA,序列,。,能结合顺式作用元件而调节基因转录活性的,蛋白质,，称为,转录调节蛋白,，在真核生物中，又称,反式作用因子（,trans,-acting factor,）,。,顺式作用元件是,DNA,序列,cis,（在,之内）,反式作用因子是蛋白质,trans,（来自,之外）,E.coli,的启动子区,（二）调控蛋白具有结合,DNA,所需的结构特征,基因特异性转录因子,（,gene specific transcription factors,）,能够与顺式作用元件特异性结合、对基因表达的转录起始过程有调控作用的蛋白质,激活蛋白或正调控蛋白,:,对基因表达有激活作用的 蛋白质,阻遏蛋白,:,对基因表达有抑制作用的蛋白质,最常见的,DNA,结合域：,1.,锌指,(zinc finger),C Cys,H His,常结合,GC,盒,2.,螺旋,-,转角,-,螺旋（,helix-turn-helix,HTH,）,同源异形结构域,二、特定蛋白质与,DNA,结合后控制转录起始,（,一）,因子和启动子决定转录是否能够起始,启动子及其与转录的关系,（二）阻遏蛋白结合操纵元件对转录起始进行负调控,阻遏蛋白是一类在转录水平对基因表达产生负调控作用的蛋白质。阻遏蛋白主要通过抑制开放启动子复合物的形成而抑制基因的转录。阻遏蛋白与,DNA,结合后，,RNA,聚合酶仍有可能与启动子结合，但不能形成开放起始复合物，不能启动转录；这种作用称为,阻遏（,repression,）,，特定的信号分子与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白失活，从,DNA,上脱落下来，称为去阻遏，或,脱阻遏（,derepression,）,。,阻遏蛋白都可以与信号分子结合而发生变构，在不同构象时，阻遏蛋白或者与,DNA,结合，或者与,DNA,解离。在可诱导型操纵子中，信号分子使阻遏物从,DNA,释放下来，解除对转录的抑制作用；在可阻遏型操纵子中，信号分子使阻遏物结合,DNA,，抑制转录。在两种情况下，阻遏蛋白结合于,DNA,后都是抑制转录，这种类型的基因表达调控称为负调控。,1.,乳糖操纵子是可诱导型操纵子,调控区,CAP,结合位点,启动子,操纵序列,结构基因,z,：,-,半乳糖苷酶,y,：通透酶,a,：乙酰基转移酶,z,y,a,O,P,DNA,I,基因,乳糖操纵子的结构,阻遏基因,mRNA,阻遏蛋白,I,DNA,z,y,a,O,P,pol,没有乳糖存在时,乳糖操纵子被阻遏蛋白封闭,mRNA,阻遏蛋白,有乳糖存在时,I,DNA,z,y,a,O,P,pol,启动转录,mRNA,乳糖,别乳糖,-,半乳糖苷酶,乳糖操纵子被诱导物开放,2.,色氨酸操纵子是可阻遏操纵子,合成代谢操纵子由合成产物关闭,合成代谢操纵子在基础状态下持续开放，在产物达到满足需要量时才关闭。,分解和合成代谢的操纵子,操纵子,基础状态,调控方式,分解代谢,关闭,由,诱导物,开放,合成代谢,开放,由,阻遏物,关闭,Trp,Tr,p,高时,Trp,低时,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA,聚合酶,RNA,聚合酶,色氨酸操纵子的作用原理,操纵子关闭,（三）激活蛋白结合正调控元件而对转录起始进行正调控,1,正调控蛋白可结合,启动子邻近序列,进行,调控,2,激活蛋白结合,增强子,可远距离进行转录,起始正调控,ntrC,蛋白对转录的正调控作用,三、原核基因表达的转录过程可通过,不同模式进行调控,一）去阻遏和正调控机制对转录起始进行,双重调控,1,乳糖操纵子受阻遏蛋白（负性调节）和,CAP,（正性调节）的协调调节,乳糖操纵子由,cAMP-CAP,系统进行正调控,TTTACA,TATGTT,N,17,N,6,A,lac,TTGACA,TATAAT,共有序列,乳糖操纵子是弱启动子，被,RNA-pol,结合后，还需,cAMP-CAP,（分解代谢物基因活化蛋白）活化,+,转录,无葡萄糖，,cAMP,浓度高时,有葡萄糖，,cAMP,浓度低时,Z,Y,A,O,P,DNA,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,结合位点,mRNA,低乳糖时,高乳糖时,葡萄糖低,cAMP,浓度高,葡萄糖高,cAMP,浓度低,RNA-pol,O,O,O,O,无转录,无转录,低水平转录,2,AraC,的别构调节使阿拉伯糖操纵子调控更精细,阿拉伯糖操纵子的调控机制,araBAD,的表达调控必需条件：,araC,、阿拉伯糖、,cAMP-CAP,当,araC,表达太多会出现自我负反馈调节,当,araBAD,表达太多，阿拉伯糖被快速代谢，结合型的,araC,下降，导致,araBAD,又关闭,C,蛋白在正常情况下结合于,araBAD,的,operator,上，量很多时才起自我负反馈,araBAD,的调控总结,（二）色氨酸操纵子的弱化机制实质是 转录与翻译调控的偶联,色氨酸操纵子,(,trp,operon),除了产物阻遏负调控外，还有转录,衰减,(attenuation),调控方式。,衰减是转录,-,翻译的偶联调控。,色氨酸操纵子,色氨酸是构成蛋白质的组分，细菌要经过许多步骤合成色氨酸。,一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。,色氨酸操纵子负责调控色氨酸的生物合成。,当培养基中有足够的色氨酸时，该操纵子自动关闭；缺乏色氨酸时，操纵子被打开。,通过色氨酸操纵子的调控可使基因的转录在两个顺式终止子结构的某处终止。,色氨酸在这里不是起诱导作用而是阻遏，能帮助阻遏蛋白发生作用 辅阻遏分子。,色氨酸操纵子结构,色氨酸的合成分,5,步，需5,种酶催化：,trpE,、,trpD,、,trpC,、,trpB,、,trpA,：,邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油,-3-,磷酶合成酶,trp,操纵子中产生阻遏物的基因是,trpR,，该基因距,trp,基因簇很远，以组成性方式低水平表达分子量为,47000,的调控蛋白,R,。,R,本身没有活性，当环境提供足够浓度色氨酸时，,R,与色氨酸结合活化，阻遏结构基因的转录。,阻遏操纵机制：粗调开关,trp,操纵子中对应于色氨酸生物合成的细调开关，控制已启动的转录是否继续。,衰减子的调控,现象：当色氨酸达到一定浓度，但还不足以活化,R,时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。,P,trp-o,与第一个结构基因,trpE,之间,162bp,的一段前导序列,(L),，实验证明当色氨酸达一定浓度时，,RNA,聚合酶的转录终止。,L,：含有编码由,14,个,aa,的,ORF,，,2,个,Trp,相连，,ORF,前有,RBS,。,色氨酸浓度很低时，,P,trp,开放，同时核糖体开始翻译。,色氨酸浓度较低时，生成的,trp-tRNA,量少，核糖体沿,mRNA,翻译移动的速度慢，赶不上,RNA,聚合酶沿,DNA,移动转录的速度，,2,区和,3,区形成双链结构（,4,区还未转录出来），前导序列中终止子结构不能形成，转录继续进行。,当色氨酸浓度较高时，,trp,tRNA,浓度随之升高核糖体不在色氨酸密码子处停止，,2,区与,3,区配对被破坏、,3,区与,4,区配对，终止子结构形成，转录减弱。,原核生物基因,表达的翻译水平调控,Regulation of Prokaryotic Gene Expression at Translation Level,第三节,一、,SD,序列决定翻译起始效率,（一）,SD,序列的碱基序列影响翻译起始的效率,SD,序列，即核糖体结合位点（,RBS,），是位于,AUG,上游,8,13,个核苷酸处的一段富含嘌呤的序列，,5-AGGAPuPuUUUPuPuAUG-3,，能与,16S,rRNA,的,3,端互补，而促进,mRNA,翻译的起始。,（二）,SD,序列的定位影响翻译起始的效率,红霉素甲基化酶,mRNA,的翻译调控,二、,mRNA,的稳定性,是决定翻译产物量的重要因素,原核生物,mRNA,分子某些片段，例如发夹有,RNase,抗性。,细胞内有结合,RNA,、使之免受,RNase,降解的保护蛋白。,近年发现，内源或外源的小分子,RNA,可特异互补结合细胞,RNA,，使其失去功能。,与减少表达量一样，降低,mRNA,稳定性也是基因表达调控方式,三、翻译产物可对翻译过程产生反馈,调节效应,核糖体蛋白控制多顺反子,mRNA,的翻译,翻译终止因子,RF-2,调节自身的翻译核糖体蛋白与,rRNA,合成是互相协调的,原核生物的,16S rRNA,与,21,种核糖体蛋白,(ribosomal proteins),，简称,r-,蛋白，组成核糖体小亚基；,5S,和,23S rRNA,与,31,种,r-,蛋白组成大亚基。大、小亚基在翻译起始组合为,70S,核糖体。,蛋白质合成是生存的最基本需要，细胞必然要严格控制,rRNA,和,r-,蛋白的比例。,核糖体蛋白基因与,RNA pol,亚基基因的多顺反子,操纵子,基因簇,表达产物,rif(rpoBC),rpL-K-A-J-L-rpoB-rpoC,L-11-1-10-12-RNApol-,rpoA,rpsM-K-D-rpoA-rpL-Q,S13-11-4-RNApol-O-L-17,spc,rpL-N-X-E-rpsN-H-rpL-F-R-rpsE-rpL-D-O,L14-24-5-S14-8-L6-18-S-5-L-30-15,r-,蛋白基因在各个操纵子上转录为多顺反子,这类操纵子有转录,-,翻译偶联调控现象，称为,自我调节（,autogenous control,）,。,四、小分子反义,RNA,参与调节蛋白质合成,（一）小分子,RNA,参与基因表达产物类型转 换的调控,（二）,小分子,RNA,参与维持极低水平的基因,表达,大肠杆菌渗透压调节中,mic RNA,的调节作用,第四节,Lambda,噬菌体的基因表达调控,Regulation of gene expression in Lambda phage,一、,Lambda,噬菌体调控区段的表达产物与生活周期有关,噬菌体的生活史,溶菌生长途径,(,l,ysis pathway),溶原菌生长途径,(lysogenic pathway),Lambda,噬菌体的溶原和裂解生活周期,Lambda,噬菌体的基因结构和调控区域,二、,cI,基因表达的阻遏蛋白封闭大部分基因使,进入溶原周期,的转录按先后分,即刻早期,(immediate early),，晚早期,(delay early),和晚期,(late),，三期的表达依次连续相互制约。,前两期转录是双向的。晚期转录单向，在环状基因组从,R,沿环到,A-J,结构区，和向左到达重组区的晚早期转录汇合，完成一个转录周期。表达产物供溶菌周期装配感染型噬菌体。,调控的主要关键在阻遏蛋白基因,cI,cI,两侧启动子受宿主,RNA pol,催化向左转录出,12S RNA,，翻译为抗终止蛋白,N,；向右转录出,7SRNA,，翻译为,Cro,蛋白。,Cro,蛋白有封闭阻遏蛋白基因的作用。,N,蛋白在,nut,位点帮助,RNA pol,越过左、右终止点,tR,和,tL,，进行晚早转录，并继续完成晚期转录。,晚期转录之前，还受另一抗终止蛋白,Q,的活化。,这些都是完成溶菌作用的必须条件,首先是,c,的表达，,C,开启,cI,。,cI,表达的阻遏蛋白结合左、右操纵序列,O,L,和,O,R,。,E.coli,的,RNA pol,结合,P,R,后不能向右转录，无法完成晚早和晚期表达，没有结构蛋白的生成。,P,L,的启动活性比,P,R,强，可使重组区表达，产物分别有附加（,att,）、整合（,int,）和切割（,xis,）作用。,完成整合后，,CIII,维持,cII,活性，,C,开启,cI,。,cI,单独表达，产生的阻遏蛋白封闭启动子，进入溶原状态。,溶原状态的建立：,Lambda,溶菌和溶原建立的调控,溶菌,溶原,