微生物学-3-3病毒.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1892年，俄罗斯伊万诺夫斯基(Ivanowski),烟草花叶病感病因子（细菌滤器滤过性）,1935年，美国生物化学家斯坦利（Stanley）,烟草花叶病毒结晶,诺贝尔化学奖(1946),HAV,HBV,三种植物病毒,SARS 电镜照片,病毒的种类：,真病毒：至少含有,核酸,和,蛋白,质两种组分,亚病毒,类病毒,拟病毒,卫星病毒,卫星RNA,朊病毒,非细胞生物,第一节 病毒的形态结构与化学组成,多数在100nm左右，一般不能在光学显微镜下看到，必须用电子显微镜观察。,最小的动物,圆环病毒,直径约17nm，最大的动物,痘病毒,（Poxviruses）直径达200nm以上，与最小的细菌相仿，可以在光学显微镜下看到。,一、病毒的大小,天花病毒,200300nm,脊髓灰质炎病毒,口蹄疫病毒,10nm,葡萄球菌,(1000nm）,牛痘病毒,300,250nm,A,B,C,D,E,F,G,立克次体,450nm,衣原体,390nm,A、大肠杆菌噬菌体,(65,95nm),B、腺病毒,(70,nm),C、脊髓灰质炎病毒,(30,nm),D、乙脑病毒,(40,nm),E、蛋白分子,(10,nm,),F、流感病毒,(100,nm),G、烟草花叶病毒,3、蝌蚪状(噬菌体),图2,病毒的各种形态,形态,1、杆状或丝状(大多为植物病毒),2、多面体或球形(大多为动物、真菌病毒),病毒的形状,二、病毒的基本结构,无囊膜病毒模式结构,有囊膜病毒模式结构,衣壳,衣壳粒,核酸,衣壳,刺突,病毒粒子,核衣壳,（基本结构）,囊膜有刺突,（非基本结构）,芯髓,（核酸）,衣壳,DNA/RNA,基因组：双股/单股,分段/不分段,多肽,（结构亚单位）,壳粒,（形态亚单位）,病毒粒子的组成及成分,三、病毒形态与主要结构类型,（一）病毒的形态,3、蝌蚪状(,噬菌体,),形态,1、杆状或丝状(大多为,植物病毒,),2、多面体或球形(大多为,动物,、真菌病毒),（二）病毒的结构类型,螺旋对称结构,二十面体对称结构,复合对称结构,无,囊,膜,杆状：烟草花叶病毒等,丝状：大肠杆菌M13噬菌体等,卷曲状：流感病毒等,弹状：狂犬病毒等,有囊膜,无,囊,膜,有,囊,膜：疱疹病毒,小型：脊髓灰质炎病毒,大型：腺病毒,有,囊,膜：痘病毒（砖块状）,无,囊,膜：大肠杆菌T偶数噬菌体（蝌蚪状）,病毒,结构类型,1、螺旋对称结构,以烟草花叶病毒（tobaco mosaic virus，,TMV,）为例，,ss,RNA,。衣壳是由2130个蛋白质亚基构成的,螺旋对称,结构，衣壳长300nm，直径1518nm，外观呈细直杆状。螺旋衣壳亚基呈,右手螺旋,排列，大约每三个核苷酸结合着一个蛋白质亚基、,RNA,长约6390bp，长度相当于2130个亚甚，约130个螺转。,2、二十面体对称结构,以,腺病毒,（adenovirus）为例,dsDNA,。腺病毒的衣壳含有252个壳粒，其中12个顶角的衣壳粒与相邻的衣壳粒组成,五邻体,，240个面上（20）或棱上（30）的衣壳粒相互之间组成,六邻体,。每个五邻体中央的衣壳粒上伸出一根末端带有顶球的,刺突,。,卫星病毒,腺病毒（adenovirus）,3、复合对称结构,具有复合对称衣壳结构的典型是,有尾噬菌体,，以大肠杆菌T4噬菌体为例。T4噬菌体的,头部,为,二十面体对称,结构，内含dsDNA，直径为5nm。噬菌体(phage)的,尾部,较为复杂，由,尾鞘、尾管、颈部、基板、尾钉和尾丝,组成。头部与尾部由,颈部,连接起来。,四、病毒的化学组成,（一）病毒的核酸,一种病毒只含有一种核酸(DNA or RNA)，动物病毒多为 dsDNA、ss RNA。植物病毒多为 ssRNA，少数为 DNA。噬菌体多为 dsDNA，真菌病毒多为dsRNA。,动物病毒,：,DNA-ds*,、DNA-ss、RNA-ds、RNA-ss,植物病毒,：DNA-ds、DNA-ss、RNA-ds、,RNA-ss*,细菌病毒,：,DNA-ds*,、DNA-ss、,RNA-ds,病毒核酸功能：是遗传变异的物质基础，控制着病毒的增殖及对宿主的感染性。,正链和负链：,正链（+）：与mRNA碱基序列相同的单链。,负链（-）：与mRNA碱基序列互补的单链。,正负链（,）：,互补的双链。,+RNA：可作为mRNA模板翻译成蛋白质。,-RNA：与+RNA互补，不能直接用作mRNA模板翻译成蛋白质。,+DNA：与-DNA互补，不能作为模板直接合成mRNA。,-DNA：mRNA模板链，可作为模板直接合成mRNA。,分节段和不分节段：,个别RNA病毒核酸为不连续、间断的链，RNA部分节段为负链，部分节段为正链，称之为,双义链,(ambisense)。不分节段可称为单分子，分两个节段称为双分子，分三个节段称为三分子，分多个节段可称为多分子。,蛋白质是病毒的主要组成部分。自然界中常见的 20 种氨基酸在病毒的结构中都可找到，但是氨基酸的组合与含量因病毒的种类而异。比较简单的,植物病毒,大都只含有,一种蛋白质,。其他病毒均由一种以上的蛋白质构成。,蛋白质的功能：,蛋白质构成病毒粒子的,外壳,；,保护病毒,核酸免受外界理化因子的破坏；,决定病毒感染的,特异性,；,决定病毒的,抗原性,。,（二）病毒的蛋白质,1、结构蛋白：指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，包括,衣壳蛋白,、,囊膜蛋白,和存在于病毒颗粒中的,酶,等。,（1）衣壳蛋白：是构成病毒衣壳结构的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的,蛋白质亚基,是构成衣壳蛋白的最小单位。一些简单的病毒的衣壳蛋白仅由一种或少数几种蛋白质构成，而一些复杂病毒则可多达20余种。Peplomere（包膜子粒）spike（刺突）,（2）囊膜蛋白或称刺突蛋白：是由,囊膜糖蛋白,和,基质蛋白,两类病毒蛋白质构成，位于囊膜表面。,囊膜糖蛋白,：病毒的主要表面抗原；囊膜糖蛋白多为病毒,吸附蛋白,。它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生，有些病毒的囊膜糖蛋白还介导病毒的进入；可能具有凝集脊椎动物红细胞、细胞融合以及酶等活性。,基质蛋白,：构成膜脂双层与核衣壳之间的亚膜结构，具有支撑囊膜，维持病毒结构的作用；介导核衣壳与囊膜糖蛋白之间的识别，在病毒出芽成熟过程中发挥重要作用。,引起SARS的冠状病毒基本结构 及 电镜图,2、,非结构蛋白,：指由病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但不结合于病毒颗粒中的蛋白质。,许多非结构蛋白具有,酶活性,，参与和调控病毒的,复制,(replication)与,转录,(transcription)。,（三）病毒的,脂类,病毒脂类是病毒在成熟释放过程中从宿主细胞获得的，主要存在于病毒的,囊膜,。脂类约占其结构成分的20%-35%。,（四）病毒的,糖类,某些病毒含有少量的糖类，主要是以寡糖侧链存在于病毒糖蛋白和糖脂中，或以粘多糖形式存在。如,糖蛋白突起（外）,、内部糖蛋白、糖基化衣壳蛋白。,第二节 病毒的主要类群与繁殖方式,1、动物病毒,2、植物病毒,3、昆虫病毒,3、噬菌体,国际病毒分类委员会,（,International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV,）。,采用目（order）、科(family)、亚科(subfamily)、属(genus)、种(species)。种以下分血清型、基因型、毒力株、变异株和分离株。,分为3大类：,DNA病毒,DNA反转录与RNA反,转录病毒,RNA病毒,一、病毒的分类系统,编号,特征,1,宿主的性质（动物、植物、细菌、昆虫、真菌）,2,核酸的性质（DNA或RNA；单链或双链；分子量；分节段或不分节段，分为几个节段(RNA病毒)；ssRNA病毒中基因组为正链或负链）,3,衣壳对称形式二十面体对称、螺旋对称、复合型对称,4,有无囊膜及囊膜对乙醚的敏感性,5,病毒颗粒或核衣壳的直径,6,二十面体病毒中的壳粒数目,7,免疫学特性,8,基因数目和基因图谱,9,病毒在细胞内复制的位置,10,有无DNA复制中间体(ssRNA病毒)；有无反转录酶,11,病毒释放的方式,12,导致的疾病或引起疾病的特异性临床症状、传播的途径,噬菌体,是感染细菌、放线菌和蓝细菌等原核微生物的病毒，分布广泛。,根据其核酸类型可分为dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒和ssRNA病毒，一般无被膜，主要有,蝌蚪形、微球形,和,丝型,。,二、细菌噬菌体,这类噬菌体侵入细菌,细胞,后，会通过,裂解,作用摧毁细胞,使病毒粒子释放,。这类能在宿主细菌细胞内增殖，产生大量子噬菌体，并通过裂解细菌细胞而释放出来的噬菌体，因而被称为,烈性噬菌体,（virulent phage），反之则称为,温和噬菌体,（temperate phage)。,（一）,烈性噬菌体,及其繁殖方式,T4噬菌体是一个典型的烈性噬菌体。,一般可分为,吸附,、,侵入,、,增殖,、,成熟（装配）,与,裂解（释放）,五步。烈性噬菌体所经历的繁殖过程，称作,裂解性周期,。,病毒的繁殖过程：,The Life Cycle of Bacteriophage T4,1、吸附（adsorption,attachment),当噬菌体与宿主细胞在水溶液中发生偶然碰撞后，如果尾丝尖端与宿主细胞表面的特异受体接触，就可触发颈须把卷紧的尾丝散开。紧接着就附着在受体上，从而使刺突、尾板固着于细胞表面。,下：,E.coli,T噬菌体吸附在,E.coli,上上：腺病毒吸附在鸡红细胞上,2、侵入(penetration,injection),噬菌体核酸注入细胞的过程，尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，,尾髓,刺入 细胞壁，并将,核酸注入,细胞内，,蛋白质外壳留在细胞外,。,脱壳,：一些病毒侵入和脱壳是连续的过程，失去病毒体的完整性被称为“脱壳(Uncoating)”，经胞饮进入细胞的病毒，衣壳可被吞噬体中的溶酶体酶降解而去除等。,（1）,融合,(Fusion)；在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆。,（2）,胞饮,(Viropexis)：由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡。,胞饮是病毒进入的常见方式,。,（3）,直接进入,：少数无囊膜病毒，如脊髓灰质炎病毒。,侵入方式：,包括,核酸的复制,和,蛋白质的生物合成,。,病毒大分子的合成过程中所发生的各种病毒复制事件存在着强烈的,时序性,，病毒基因组的,转录是分期,进行。,3、增殖,（replication),正链RNA(+RNA),负链RNA(-RNA）,正链DNA(+DNA),负链DNA-DNA）,正负链(DNA）,正负链(RNA）,4、成熟/装配（maturity/assembly),噬菌体的成熟过程实际上是其已合成的各部件的装配过程。在,T4,噬菌体的装配过程中，约有,30,个不同的蛋白和至少,47,个基因参与。,5、裂解释放(lysis,release),当宿主细胞内的大量子代噬菌体已成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用，从细胞内部促进了细胞的裂解，从而实现了噬菌体的释放,(release),。,每一个宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体量称,裂解量,（,burst size),。,左：疱疹病毒 右：流感病毒,方式：,裂解,：多以裂解细胞的方式释放。,出芽,：噬菌体分泌穿出细胞，细胞并不裂解。,通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成,100-300,个子噬菌体。,（二）,噬菌体效价,1.,效价,（titre）：,表示每毫升试样中所含有的侵染性的噬菌体粒子数，也即,噬菌斑形成单位,（,pfu,，plaque-forming unit）数或感染中心（infective centre）数。,噬菌斑,2.噬菌斑:,在涂布有敏感宿主细胞的固体培养基表面，若接种上相应噬菌体粒子由于先侵染和裂解一个细胞，然后以此为中心，再反复侵染和裂解周围大量的细胞，结果在菌苔上形成一个具有,一定形状、大小、边缘和透明度,的噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。),应用:,噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数,噬菌斑（负菌落）,细菌菌落,3.效价测定方法：,双层平板法,（三）病毒的群体形态：,（1）,噬菌斑,（2）,空斑,(plaque)：,动物细胞,被病毒侵染后的死细胞群落。,（3）,病斑,：动物细胞受,肿瘤病毒,感染后细胞剧增形成的病灶。,（4）,枯斑,(lesion)植物叶片上的,植物病毒,群体。,（5）,包涵体,（inclusion body),（5）包涵体,某些受病毒感染的细胞内，用普通光学显微镜可看到有与正常细胞结构和着色不同的圆形或椭圆形斑块，称为,包涵体,。因病毒种类不同，包涵体有位于胞浆内的(痘病毒)，也有在细胞核内的(疱疹病毒)；或者两者都有(麻疹病毒)。,包涵体的本质：,有些病毒的包涵体就是病毒颗粒的,聚集体,；,有些是病毒,增殖,留下的,痕迹,；,病毒感染引起的,细胞反应物,，,故可作为诊断依据和鉴定病毒的参考,。,如从可疑为狂犬病的脑组织切片或涂片中发现细胞内有嗜酸性包涵体，即,内基小体(,Negri body)，可诊断为狂犬病。,感染后培养过程,被噬菌体侵染的,菌群培养过程,定时取培养液与敏,感菌混合平板培养,不同取样时间培养液与敏感菌混合平板培养产生的噬菌斑数量的动态,（四）一步生长曲线,以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为纵坐标，绘制成的曲线为,一步生长曲线,，定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。,反映每种噬菌体,的三个最重要的,特性参数：,潜伏期（隐晦期）,裂解期,裂解量,潜伏期,：,从噬菌体吸附细菌到第一个噬菌体粒子装配之前的这段时期。噬菌体数无变化。样品中无游离的噬菌体。(5-10min),裂解期,：,曲线直线上升，子代噬菌体不断释放到培养基中，直到达到一个极限。(20-30min),稳定期,：,感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。,裂解量,：每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。,稳定期噬菌斑数,裂解量=,潜伏期噬菌斑数,不同的噬菌体或同,种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同，与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及环境因素有关。一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达,数百乃至上万个,。,温和噬菌体：,噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核,DNA上，并且可以随宿主DNA,的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,原噬菌体（或前噬菌体）：,即整合在宿主核,DNA上的噬菌体的核酸。,溶原性细菌：,指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。,（四）温和噬菌体与溶源性细菌,前噬菌体,1)可稳定遗传,：子代细菌都含有,原噬菌体，均具有溶原性。,2)可裂解,：温和噬菌体的核酸也可从宿主,DNA,上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10,-2,-10,-5,。此外用化学、物理方法可诱导裂解。,3)可复愈,：自然遗失前噬菌体，变为非溶源性细菌，不再发生自发裂解和诱导裂解。,溶原性细菌的特点：,4)溶源转变（lysogenic conversion）：,由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。例如，,白喉棒状杆菌,和,肉毒梭状芽孢杆菌,，若不含有前噬菌体的话，是不会引起人类疾病的。,5)免疫作用：,前噬菌体基因导致溶原性细菌对同类型噬菌体的侵染具有免疫作用，阻止,相同噬菌体,的吸附和生物合成，但不能阻止它种类型噬菌体所侵染。,二、病毒的宿主范围,按宿主种类划分：,Plant,Viruses,Insect,Viruses,Animal,Viruses,虫媒病毒,（arbovirus）：以蚊、蜱、螨、白蛉等节肢动物为媒介，在脊椎动物中广泛传播的病毒。,（一）动物病毒,动物病毒指的是寄生于脊椎动物和无脊椎动物细胞内的病毒，引起人和动物的多种疾病，如艾滋病（获得性免役缺陷综合症，,ADIS,）、非典型肺炎（严重急性呼吸道综合症，,SARS,）、流行性感冒、肝炎和麻疹等。大多数家畜也感染病毒，如口蹄疫、狂犬病、猪瘟和禽流感等。,动物病毒还可以引起肿瘤,。动物病毒,部分为DNA型，部分为RNA型,。,Smallpox(天花),1400BC，埃及孟非思壁画中长老患小儿麻痹症。,脊髓灰质炎病毒,爱滋病（AIDS）,1981年，美国加州大学医院诊断出首例艾滋病，并把此症命名为“,获得性免疫缺陷综合症,（AIDS）,”,艾滋病病毒human immunodeficiency virus,HIV),何大一,(1952-)，美籍华裔科学家，是艾滋病鸡尾酒疗法的发明人。,何谓“鸡尾酒”疗法？,这种疗法将蛋白酶抑制剂药物和核苷类逆转录酶抑制剂及非核苷类逆转录酶抑制剂药物组合使用，能更有效地治疗艾滋病。,HIV是一种很难对付的病毒。它会不停地异样变化，每次破裂时都会犯纰缪，不能精确地复制遗传信息，就像打字出了错同样，没有纠错机制。而且复制很快，每天都可以孕育发生上亿甚或上千亿的新个别，其速度是爆炸性的。这些个特征可使病毒逃脱药物的进犯。如果只用一种药物，HIV病毒只要做小小的变化就可以存活，甚或还孕育发生抗药性，这正是鸡尾酒疗法的基来历根基理。,非典型肺炎（严重急性呼吸道综合症，,Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS,）,Prof.Y.GUAN,Ecology and evolution of influenza A viruses in southern China,Identification of the emergency of animal influenza viruses with pandemic potential,Ecology of SARS,Research Interests:,Foot and Mouth Disease,口蹄疫,新显病毒,（emerging virus)，“emerge”,的英文原意是“出现”的意思，新显病毒是指那些以往局部低水平感染的病毒或具有种间屏障的病毒，将其寄主范围扩大到了别的物种，引起了大范围的人类传染性疾病。,近几年的SARS病毒、禽流感病毒等就属于这一类。,新显病毒产生的原因：,1）与人类对环境的破坏有关。,2）与现代交通、旅游发展和人类大规模地迁居有关。,3）病毒基因的突变，改变了宿主范围或致病力。,4）与人和动物的密切接触有关。,照片中蓝色部分是,H5N1禽流感病毒,石正丽，女，1964年出生，博士，研究员。长期从事动物新发病毒的研究，在水生甲壳类动物新发病毒的分离和鉴定、病毒的超微结构、病毒的分子生物学和病毒早期检测技术方面有长期的积累和研究经验。,2004年开始从事SARS病毒溯源研究，在蝙蝠体内发现SARS样冠状病毒，证实蝙蝠是SARS样冠状病毒的自然宿主。,新发病毒学科组 Emerging Viruses,Li W.,Shi Z.*,et al.Bats are natural reservoirs of SARS-like coronaviruses.,Science,2005,310(5748):676-679.,被病毒感染的植物,（二）植物病毒,植物病毒的种类很多，其命名通常是结合,寄主植物,和,致病类型,，如,烟草花叶病病毒、水稻黄矮病病毒、马铃薯退化病病毒,等,植物病毒绝大,多数是,RNA,型,，少数为,DNA,型,专化性并不强,，往往一种病毒可寄生在不同种、属甚至不同科的植物上,侵入方式都是,被动的,：昆虫刺吸式口器、带病汁液与植物伤口相接触,在植物组织中，则可借,细胞间连丝,实现病毒粒的扩散和传播。,与噬菌体不同的是，植物病毒必须在,侵入宿主细胞后,才脱去衣壳即,脱壳,(,uncoating,),。,大多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成,包涵体,，可在细胞核或细胞质内形成，功能是保护病毒粒免受外界不良环境的破坏。包涵体在显微镜下一般均呈多角状，称为,多角体,（polyhedron）,斜纹夜蛾病毒杀虫剂及甜菜夜蛾病毒,杀虫剂：一种,核型多角体病毒（NPV）,核型多角体病毒（NPV,，nuclear polyhedrosis virus），多角体于细胞核内形成，为杆状病毒，是一种大型昆虫病毒。,质型多角体病毒（CPV,，cytoplasmic polyhedrosis virus），多角体于细胞质内出现，为球状病毒。,（三）昆虫病毒,第二节 亚病毒,凡在核酸和蛋白质两种成分中，只含其中之一的分子病原体，称为,亚病毒,，包括,类病毒、卫星病毒,、卫星RNA(,拟病毒,)和,朊病毒,。,一、类病毒,在1971年T.O.Diener发现,马铃薯纺锤形块茎病,（PSTD）是由类病毒（viroid）引起的。,类病毒的特点：,1、结构简单，只含RNA一种成分，目前只在植物体中发现。,2、核酸为裸露的环状ssRNA，由2个互补的半体（179bp，180bp)组成，形成一条长50nm的棒状dsRNA分子。,3、类病毒RNA可侵染寄主，侵入后能自我复制。,4、严格专性寄生在活细胞内。,二、卫星病毒,基因组缺损，需要依赖辅助病毒，基因才能复制和表达，才能完成增殖的亚病毒因子。,如丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）必须利用乙型肝炎病毒（HBV）的包膜蛋白才能完成复制周期。,卫星病毒的特点：,认为是一类包裹在病毒粒子中的有缺陷的类病毒,一般仅由裸露的,RNA或DNA,组成,“寄生”于真病毒内-,辅助病毒,（helper virus）,其复制必须,依赖辅助病毒,三、卫星RNA(拟病毒),卫星RNA(sat-RNA），又称,类类病毒,或,拟病毒,，是一类寄生于辅助病毒壳体内，必须依赖辅助病毒才能复制的RNA分子片断。,卫星RNA在许多植物病毒中发现，1981年首次在,绒毛烟的斑驳病毒,（VTMoV）中分离到。VTMoV核心中除含有大分子线状ssRNA（RNA-1）外，还含有环状ssRNA（RNA-2）及其线状形式（RNA-3)，后两者即为卫星RNA。,实验证明，只有当RNA-1（辅助病毒）与RNA-2 或RNA-3（卫星RNA）合在一起才能感染和复制，单独不能复制。,但是卫星RNA能影响其辅助病毒在宿主中感染寄主的症状。,亚病毒包括卫星病毒、卫星 RNA、类病毒和朊病毒。在亚病毒因子中，仅有类病毒和朊病毒能独立复制；朊病毒颗粒不具有基因组核酸；卫星病毒与卫星 RNA 都具有核酸基因组，它们与 DI 颗粒类似，必须依赖辅助病毒进行复制，与 DI 颗粒不同的是，它们与其辅助病毒,没有核酸序列同源性,。卫星病毒、卫星 RNA、类病毒和 DI 颗粒的性质比较表：,性质,DI 颗粒,卫星病毒,卫星 RN A,类病毒,依赖辅助病毒复制,是,是,是,否,特异性外壳壳体化,否,是,否,否,辅助病毒外壳壳体化,是 a,否,是,否,抑制辅助病毒复制,是,是,是,-,与辅助病毒序列同源性,是,否 b,否 c,-,在体内和体外 RNA 的稳定性低,低,高,高,a：因缺失部位而有所不同，脊髓灰质炎病毒 DI RNA 能复制但不被壳体化,b:STMV 基因组的 3 端与辅助病毒有序列和结构的相似性,c:某些嵌合的卫星 RNA 与其辅助病毒基因组有广泛的 3 序列同源性,四、朊病毒,（prion，virino）,朊病毒，又称“普列昂”或蛋白质侵染因子，是一类具有侵染性、不含核酸，并能在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。,如人的库鲁病（Kuru）、疯牛病（mad cow disease，牛海绵状脑病（Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE）等的病原体为朊病毒，这些疾病潜伏期长，对中枢神经系统的功能有严重的影响。,1982年，美国科学家S.B.Prusiner在研究,羊搔痒病,病原体时发现朊病毒，并因此获得1997年诺贝尔生理学和医学奖。,朊病毒通常借食物进入消化道，再经淋巴系统侵入大脑。,prion,朊病毒引起的库鲁病,1.动物接种,是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于,小鼠,脑内，痘病毒可接种于,家兔,角膜或皮内。,2.鸡胚培养,鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9-14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。,盲传（blind passage）：,将取自经接种而末出现感染症状的宿主或细胞培养的材料，再接种于新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力或效价。,第三节 病毒的分离培养,动物病毒：动物接种、,鸡胚接种,和组织培养技术,噬菌体：双层琼脂法培养,（一）病毒分离培养方法,有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为,细胞病变效应(CPE),。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。,3.细胞培养,细胞的变化：,有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为,致细胞病变作用,(Cytopathic effect,CPE,）,。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。,有些病毒如麻疹病毒、,CMV,、,RSV等作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称,融合细胞,。,有些病毒,(,如狂犬病病毒、麻疹病毒等,),可在培养细胞中形成胞浆或核内的,包涵体,。,（二）病毒的测定（assay of viruses）,病毒测定即病毒的定量分析。,(1),病毒的物理颗粒计数,1.,电镜计数:,将待测病毒样品与已知数目的聚苯乙烯乳胶颗粒均匀混合后置电镜观察，统计病毒颗粒数目与乳胶颗粒数目，根据两类颗粒数目之比即可计算出待测样品中的病毒颗粒数目。,HBV,三种植物病毒,1:1,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560,每孔分别加入等体积一定浓度的红球血细胞,置室温孵育一定时间,观察结果并计算病毒血凝效价,2.,血细胞凝集试验,:,具有HA的病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。,血细胞凝集试验,由于具有血凝性质的病毒所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比，根据这一原理设计的血细胞凝集试验即可用于病毒定量测定。,3.,血凝抑制试验,(hemagglutinatia inhibition test,HI test),其原理是相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。本试验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。,病毒 +鸡RBC =,凝集（血凝试验）病毒 +特异性抗体+鸡RBC=不凝集,（血凝抑制试验）,（三）病毒的感染性测定（assay of viral infectivity）,感染性测定:,测定因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性感染反应的病毒数量。,感染单位,（infectious units,IU）:引起宿主或宿主细胞培养一定特异性反应的病毒最小剂量,效价（title）：,单位体积（ml）病毒原液所含的病毒感染单位的数目（I/ml）。,1、,噬（蚀）斑测定,(1）噬菌体的噬菌斑测定，琼脂叠层法（agar layer method）,(2)动物病毒的蚀斑测定,空斑,测定,转化,测定,合胞体计数,(3)植物病毒的环死斑测定:,半叶法,、,终点法,（end point method）,取等体积的经倍比稀释的病毒系列稀释液分别接种大量同样的试验单元（如实验动物、鸡胚或细胞培养），经过一段时间孵育后，以试验单元群体的半数（50%）个体出现某一感染反应的病毒剂量，来确定病毒样品的效价，称做,半数效应剂量,，并以50试验单元出现感染反应的病毒稀释度的倒数的,对数值,表示。,根据试验单元及感染反应的性质分为：,半数致死剂量（50%lethal dose,LD,50,）,半数感染剂量（50%infective dose,ID,50,）,半数组织培养感染剂量（50%tissue culture infective dose,TCID,50,）,终点测定实验记录举例,病毒稀释度,接种动物数,死亡数,存活数,累积值,总死亡数,总存活数,死亡比例,死亡率(%),10,-1,6,6,0,17,0,17/17,100,10-,2,6,6,0,11,0,11/11,100,10,-3,6,4,2,5,2,5/7,71,10,-4,6,1,5,1,7,1/8,13,10,-5,6,0,6,0,13,0/13,0,根据,Reed-Muench法,半数效应剂量(LD,50,ID,50,或TCID,50,),=50%感染率的高临界稀释度倒数的对数距离比稀释系数的对数。,上式中：,距离比,在上例中，距离比71-50/71-13=0.36 稀释系数为10,故LD,50,=log1/10,-3,+0.36Xlog10=3.36,即该待测样品的LD50效价是,10,-3.36,1、中和试验(neutralizing test,NT test),：,在病毒的中和作用（neutralization）性质上建立，即某些特异性的病毒抗体与病毒作用后，能够使其失去感染性，抑制病毒的繁殖。这类病毒抗体称做,中和抗体,（neutralizing Abs）。并且一种病毒的感染性只能被其特异性的中和抗体中和，而中和一定量的病毒的感染性必须有一定效价的抗血清。,2.补体结合试验(complement fixation test,CF test),用已知病毒可溶性(CF)抗原来检测病人血清中相应(CF)抗体。CF抗原是病毒的内部抗原，同种异型间常有交叉，故特异性较中和试验低。但CF抗体出现较早，消失较快，故CF阳性可作为,近期感染的指标,。,3、,血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test,HI test),（四）病毒的血清学测定,（五）病毒蛋白抗原检查,用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标记抗体，采用免疫学和分子生物学技术，检测标本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特异、快速等优点。,1.,免疫荧光技术(immunofluorescence,IF),2.固相放射免疫测定,(solid-phase radioimmunoassay,SPRIA),3.,酶免疫技术,(enzyme immunoassay,EIA)此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。,免疫荧光定位,（六）检测病毒核酸,1.,核酸杂交技术,用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。,2.,核酸扩增法,目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。,3.,基因芯片技术,第四节 病毒与实践,有害的方面,：,(1)噬菌体与发酵工业,(2)动物病毒病,(3)植物病毒病,有益的方面,：,(1)昆虫病毒用于生物防治,(2)病毒在基因工程中的应用,1）噬菌体的发生在工业生产上会造成,发酵液污染,，影响发酵产量和质量，甚至引起倒罐，造成重大损失。,2）噬菌体在分子生物学研究中也有着广泛的应用，如大肠杆菌的噬菌体作为,基因工程,的载体；大肠杆菌M13,噬菌体展示技术,用于多肽或蛋白质的表达并展示于噬菌体表面，研究蛋白质相互作用。,研究噬菌体的意义：,1),控制和消灭有害病毒,，,病毒威胁着人类健康和家养动物养殖业，病毒性疾病对国民经济造成严重的影响，发酵工业中的噬菌体污染会严重影响发酵生产；,2)病毒的,研究和利用价值,，主要表现为改良品种，培育活病毒疫苗株，保护生态环境，利用病毒作为昆虫杀虫剂，基因工程研究的重要载体。,研究病毒的重要意义：,