CD三四细胞分离及其体外扩增课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,CD34+细胞,CD34+细胞是造血干细胞的表面标志分子。,细胞表面CD34+抗原是一种相对分子质量为110-120kD的高度糖基化的,型膜蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细胞以及少量内皮细胞表面。,CD34+细胞在骨髓，脐带血以及外周血中都有存在。用常规方法一般难以有效分离。原因主要在于CD34+抗原表达的拷贝较低，抗CD34+的亲和力低，表达CD34+抗原的细胞存在于一个不均一的本底细胞群中且数量极少。,分离CD34+细胞的方法,荧光激活细胞分选,免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析法；免疫磁珠法）,细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计数流式法）,流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获得高纯度的CD34+细胞，但是由于得量较少，受无菌实验条件等方面的限制，所以应用较少。,细胞物理参数系统分离CD34+细胞得率较低，而且需要提供足够的细胞量。,目前常用于分离CD34+细胞的方法主要是免疫吸附法（systems based on immunoadsorption)。,尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads)的方法应用更为广泛。,CD34+细胞分离方法比较,分离方法,细胞得率,难易程度,细胞纯度,分离速度,条件,荧光激活细胞计数,少,难,高,慢,高,免疫磁珠吸附分离,大,易,高,快,经济,细胞物理特性分离,低,易,低,快,经济,免疫磁珠吸附分离,CD34+细胞,利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合，使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血细胞培养，扩增，基因转染，建立造血干细胞库等实验。,实验材料：,1.脐带血，外周血及骨髓标本；,2.PBS缓冲溶液；,3.10BSA；,4.10mmol/LEDTA；,5.淋巴细胞分离液；,6.MACS磁性分离仪；,7.MACS分离试剂盒；,操作步骤,1.配制含1%BSA和5mmol/L EDTA的PBS缓冲溶液。,2.利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；,3.将1*108个单个核细胞悬浮于300ul缓冲液中，利用MACS磁性分离试剂盒制备细胞悬液500ul；,4.将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓慢通过分离柱。洗脱组分为CD34-细胞；,5.将分离柱移出磁场，加1ml 缓冲液加压洗脱，收集CD34+细胞。,6.用免疫细胞化学和FACS分析CD34+细胞纯度,分离结果,分离前，脐带血和骨髓的CD34+细胞占单个核细胞的1-4%，外周血仅为0.2%。,分离后，CD34+细胞可达95-99%。CD34+抗原组则99.6%的细胞为CD34-细胞。,回收率达70-75%，免疫磁珠分离方法得到的CD34+细胞纯度和回收率均较高。,体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞的比较,目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细胞（MNC）和CD34+富集细胞，对比考察这两种细胞扩增，集落形成和CD34+细胞扩增等特性。,王斌，康自珍，迟占有等。体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞。,生物工程学报，2002,5(18),343-347,.,方法,1.Ficoll 密度梯度离心收集单个核细胞;,2.免疫磁珠分离纯化CD34+细胞.,3.MNC接种密度为5*105 cells/ml.CD34+细胞为2*104 cells/ml于24孔板，每周取样计数，集落检测和流式细胞分析.,结果,脐血CD34+细胞的分离结果,MNC扩增到第28天，细胞总数开始呈下降趋势，而另一组则持续扩增8周。在前4周中，MNC的扩增倍数远低于CD34+富集细胞,造血干/祖细胞集落密度分析,细胞于半固体培养体系中进行集落分析，MNC的CFU-GM和BFU-E集落密度都有上升，下降的过程，而CD34+富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者BFU-E到第3周就很难检测到了。,集落密度=集落/细胞数,造血干/祖细胞总集落扩增分析,总集落数=集落密度*细胞总数,MNC的CFU-GM和BFU-E的扩增倍数在14天达到最大值，然后开始下降。CD34+富集细胞的CFU-GM第35天达到最大值，CFU-E在第14天达到最大值。后者的CFU-GM最大扩增倍数远大于前者。,分析可以看出，MNC的集落在培养过程中其集落密度和集落数量都曾实现了增高。,而CD34+富集细胞的集落只实现了数量上的扩增，单个细胞所形成的集落数并没有明显的增高过程。,显示，MNC的CD34+细胞的扩增倍数在第14天达到了最大值，随后开始下降，CD34+富集细胞则如终呈上升趋势，在第35天达到了最大值。,经过体外长期培养，由CD34+富集细胞培养所得的CD34+细胞总数和CFU-GM（粒细胞-单核细胞集落生成单位）总数均高于MNC。,小结,经过体外培养，培养前期MNC的CD34-可能对CD34+细胞及集落形成细胞的扩增有促进作用；,而CD34+富集细胞在培养过程中分化趋势始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说明在培养中存在大量分化。,讨论与总结,MACS技术在实验室处理低细胞量情况下，是目前纯化CD34+细胞较好的方法。,CD34+细胞具有良好的扩增潜力，通过体外培养，5周内即可以得到更多的CFU-GM形成细胞和CD34+细胞。,CD34+细胞的大量扩增为造血干/祖细胞的定向诱导分化提供了有利条件。,谢谢,