1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,cre_loxp基因敲除系统解读,背景介绍,1981,年,Evans,等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系,1985,年,Smithies,最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组,一、,Cre/Loxp,系统,Cre,重组酶（,37,）,位点特异性重组酶，介导,loxp,位点间的序列同源重组,70%,重组率，无需辅助因子，多种,结构的,DNA,底物,Loxp,site,34bp,反向重复序列,Flp/Frt,重组系统,P1噬菌体,（1）重组方式,（2）基因敲除机理,Offspring：
2、50%heterozygous knockout after 1 generation,基因敲除机理,（续）,Offspring:25%homozygous knockout after 2 generation,二、基因敲除的基本流程,（1）打靶载体构建,Conditional Knockout,Exon1,3N,GT/AG,Attention:,（2）转化ES细胞,电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞,电转需要的细胞数量2-5x107,（3）阳性克隆筛选,随机整合,定点整合,没有整合,DTA(白喉毒素A亚基）,（4）囊胚注射,小鼠的遗传背景取决于ES和囊胚细胞,（5）嵌合体
3、小鼠,（6）品系纯化,Loxp,2,小鼠品系建立完成,纯合突变小鼠用来和,Cre,小鼠杂交，杂合突变小鼠保种,三、,Cre,工具鼠的构建,DNA显微原核注射，是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。,诱导性组织特异性,Cre,工具鼠的载体构建,D.S.Sohal,M.Nghiem.Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cr
4、e protein.Circ Res,.,89:20-25(2001).,MHC,(cardiac-specific a-myosin heavy chain),Mer,(mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599,G525R),MerCreMer,融合蛋白,该系统将雌激素受体(,Estrogen Receptor,ER,)的配体结合区(,ligand-binding domain,LBD,)和,Cre,重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥,Cre,重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与,loxP,位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。,The End,Thank you all for your attentions!,
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