医学昆虫病原细菌.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,昆虫病原细菌,昆虫受细菌感染而引起的疾病称之为,细菌病,，细菌病的共同特征是当昆虫被细菌感染以后，都不再活动，,食欲减退，以后口腔与肛门有排泄物排出等现象,。大多数的病原菌侵入昆虫体腔后，常常引起感染而引起,败血症,。死后的虫体颜色加深，迅速变为褐色或黑色，虫体大都软化腐烂，失去原形，内部组织亦可能因溃烂而呈粘着性，一般还带有臭味。昆虫的细菌病通称为,软化病,。软化病都,具有传染性,，在任何地区、任何时期都易发生流行。一、昆虫病原细菌的主要类群,一、专性病原细菌,金龟子乳状病病原细菌,二、兼性芽孢细菌,苏云金杆菌,、,蜡质杆菌,三、潜能无芽孢病原细菌,包括假单孢菌科曲铜绿极毛杆菌、萤光极毛杆菌和肠杆菌科的气杆菌、变形杆菌等,四、兼性无芽孢病原细菌,粘质赛氏杆菌,微生物杀虫病原细菌应该具备基本的属性,：,(1),毒力高菌剂毒力足以压倒害虫的抗病力，能够稳定可靠地使害虫,发病致死,。,(2),稳定性,菌剂不致因受自然环境影响,(,如日光、干燥等,),、人工处理、悬浮剂、载体、贮藏、不同施药方式等而减低杀虫效力,(3),残效期长,，并有在害虫种群中自然传播的能力。,(4),作用,迅速,。,(5),有,选择性,即对防治对象剧毒，而对植物、益虫以及哺乳动物等无毒。,(6),可以大规模生产，经济安全,苏云金杆菌（,Bacillus thuringiensis,简称,B.t,）是具有伴孢晶体和外毒素的细菌，能杀死许多种鳞翅目、膜翅目、双翅目和鞘翅目的昆虫，如危害松树的松毛虫，危害国槐、杨、柳、桦、云杉、松树和多种灌木的槐尺蠖、春尺蠖、云杉尺蠖、柳毒蛾、杨小舟蛾、黑点叶蜂、松叶蜂、天幕毛虫等。,二、苏云金杆菌,苏云金,芽孢杆菌,本病病原细菌属真细菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。学名苏云金芽孢杆菌（,Bacillus thuringiensis,subsp.sotto Ishiwatas,）。,苏云金杆菌的发现有上百年的历史，最初日本人石渡（,Ishiwata,）在,1901,年从病蚕尸体中分离出一株所谓卒倒细菌（,sotto bacteria,）。按现在的分类系统，石渡当时所分离出来的菌株，应该是苏云金杆菌猝倒变种（,B.thuringiensis,Var.sotto),，属血清型,4a,4b,。,1,、发现史,1911,年昆虫病理学家,Berliner,在德国苏云金,Thutingn,的一个面粉厂的地中海粉斑螟,Anagasta ruchniela,患病幼虫中又分离到这种产伴孢晶体的芽孢杆菌，,1915,年定名为苏云金芽孢杆菌，一般称苏云金杆菌。他指明苏云金杆菌含有,伴胞晶体,(Parasporal Crystal),，但未曾说明苏云金杆菌的孢晶体有杀虫作用。,Berliner,所定名的苏云金杆菌按现在的分类系统，应该是苏云金杆菌苏云金变种,(,B.thuringiensis,Var.thuringiensis),，属血清型。,从,1920,年到,1950,年这一段时期内，有许多人曾用苏云金杆菌进行防治害虫的田间试验。到了,50,年代,才发现苏云金杆菌杀虫的活性。,1956,年,Angus,证实杀虫活性物质位于伴孢晶体之中。,他将伴孢晶体与孢子分开之后，单独伴孢晶体仍然存在杀虫活性。经过多次反复研究，有关科学家都认识苏云金杆菌的杀虫谱主要是鳞翅目昆虫幼虫，部分菌株对双翅目或鞘翅目昆虫幼虫有毒性，还有一些菌株或亚种的毒力还未得到证明。但鳞翅目昆虫中对此病原体也并非具有同样的敏感性，宿主昆虫不同，苏云金杆菌变种品系不同，试验条件不同等因素，所得的结果不一。,1957,年，美国商品制剂,Thuricide,出现，苏云金杆菌的使用范围和面积得到很快的扩大,在世界各地及我国许多地方陆续分离到苏云金杆菌的新亚种，目前已知的有,45,个血清型约,60,个亚种。由于苏云金杆菌及其亚种作为细菌农药而被重视和广泛研究。,卒倒杆菌有营养菌体、孢子囊及芽孢等几种形态，能产生,、,、,外毒素及,内毒素等多种毒素。,2,、形态和生物学特性,三个发育阶段,1,营养体,呈杆状，两端钝圆，较为粗壮，与蜡质杆菌近似,，,营养体在芽孢出现前先停止繁殖，细胞质浓缩，出现液泡和微粒，并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。此时繁殖快、代谢旺盛，适于用作接种材料。,2,芽孢囊,当菌体成长老熟时，其一端斜生一个椭圆形的芽孢，另一端同时出现菱形,(,或其他形状,),的晶体即伴孢晶体,此时为芽孢囊阶段。,3,芽孢和伴孢晶体的释放,芽孢囊到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢和伴孢晶体。,能产生伴孢晶体并对某些昆虫有毒是苏云金杆菌区别于蜡质杆菌的主要特征。,苏云金杆菌的生理生化反应是,:,引起牛乳凝固，在葡萄糖、果糖、甘油、可溶性淀粉麦芽糖、海藻二糖中产酸，不产生吲哚，对甲基红正反应，乙酰甲基甲醇,(V-P,反应,),正反应,(,多数变种,),，还原硝酸盐为亚硝酸盐，不还原硫酸盐为硫化物，磷酸脂酶产生无红色颗粒出现。,病原的几种形态,（一）营养菌体,杆状，端部圆形。大小为,2.24.01.01.3m,。周生鞭毛，鞭毛有特异抗原性，可作为血清型分类的依据。以二裂法繁殖，往往多个菌体连成链状。革兰氏呈阳性反应。在平面培养基上形成圆形菌落，边缘整齐，乳白色，有光泽。生长最适温度为,2832,，高限,4045,，低限,1015,，适宜于中性,ph,范围。能利用葡萄糖、海藻糖等作碳源，并能产生酸；能使牛乳凝固及明胶分解；具,外毒素使卵黄琼脂培养基液化。根据其生理生化反应可作为分类和识别亚种的依据。,（二）孢子囊,营养菌体生长到一定时间后，受营养或环境因素的影响，能形成孢子囊。此时，发生许多细胞学和生物化学的变化，菌体先合成孢外酶（即,外毒素），分泌于菌体外，可能有助于菌体分解和吸收某些形成孢子囊所必须的物质。其后，在孢子囊的一端形成芽孢。同时，在另一端形成蛋白结晶，叫伴孢晶体（即,内毒素）。不久，孢子囊溶解而将它们释放出来。和伴孢晶体形成期细菌形态所发生的变化可划分为如下几个阶段：首先是两个染色质凝集和形成相当宽的轴丝，位于细胞中央（,），接着染色轴丝分离，其中之一移至细胞的一端，在中体的参与下发生细胞膜陷入，完成前芽孢隔膜（,）。前芽孢隔膜延伸将芽孢包围，芽孢从母细胞质中游离出来（,）。其后，在芽孢周围形成皮层、孢子壳及外膜，芽孢成熟（,）。,在第,期的初期，于细胞的另一端开始形成蛋白结晶，即伴孢晶体，并逐渐增大，在前芽孢游离时期接近成熟。伴孢晶体和芽孢成熟后，孢子囊溶解而将它们释放出来。,（三）芽孢,是菌体的休眠阶段，呈圆筒形或卵圆形，大小为,1.51.0m,。有折光性，不易着色，能抵抗不良环境，在干燥、高温或低温冷冻条件下，能保持相当长时间的活力，遇到适宜条件时即会发芽成为营养菌体。,（四）毒素,苏云金杆菌在其生长发育过程中能产生多种对昆虫有致病力的毒素，一类为内毒素，另一类为外毒素。,内毒素,又称,内毒素、晶体毒素、伴孢晶体、苏云金杆菌蛋白（,Bt toic protein,）或杀虫晶体蛋白（,Insecticidal Crystal proteins,即,ICPs,）。这是在芽孢形成的同时，在其营养菌体的另一端合成一种或几种杀虫晶体蛋白（,ICPs,）组成的伴孢晶体。伴孢晶体的形态有菱形、球形、立方形、不规则形和镶嵌形等多种形态，以菱形较为常见。不同亚种的菌株，晶体形态不尽相同，菱形晶体的大小为,1,20.5um,。电子显微镜观察菱形晶体是一个八面包封的双锥体，表面有粗糙的平衡的条纹，条纹间的距离为,26nm,，亚单位呈杆状或哑铃状，大小为,5.015.5nm,，具有含硅的骨架。不溶于水及丙酮、三氯甲烷、乙醚、苯等有机溶剂，对酸稳定，但能溶于碱性溶液，,家蚕的碱性胃液可将之溶解,。三氯醋酸、氯化汞等常用蛋白质沉淀剂，可使晶体和溶解了的晶体蛋白质失活。晶体毒素在广泛的,pH,值范围内稳定，卒倒亚种晶体毒素在,pH11,12,氢氧化钠,pH4,4.5,醋酸缓冲液中稳定，在,pH3.3,以下失去活性，对热有一定的稳定性，在,6.5,可保持,1hr,，,80,处理,20min,也不致破坏。伴孢晶体由,18,种氨基酸组成。,据报道，可把晶体蛋白分,:,对鳞翅目有活性的,Cry,类,对鳞翅目和双翅目有活性的,Cry,类,对鞘翅目有活性的,Cry,类,对双翅目有活性的,Cry,类,对鳞翅目和鞘翅目有活性的,Cry,类,对双翅目昆虫有毒性且对无脊椎动物和脊椎动物具有明显溶细胞作用的,Cyt,类等六大类若干亚类，,其编码基因也相应分为,6,类若干单元。,不同亚种的伴孢晶体，对家蚕的毒性不同，如苏云金杆菌亚种中，卒倒亚种和杀虫亚种的伴孢晶体，经口添食五龄家蚕的,ED50,分别为每克体重,26,，,0.02,。,外毒素,外毒素是菌体在其生长过程中分泌于细胞外的代谢产物，已发现的主要有以下几种：,（,1,）,-,外毒素,是一种可溶性酶类，即磷脂酶,C,。这种毒素能够影响到许多细胞，首先影响到,磷脂膜,，造成细胞的破裂或坏死，使昆虫肠道中的细菌易于进入体腔，从而破坏了宿主昆虫的正常防御机制。磷脂酶作用的最适,pH,是,6.6,7.4,，与叶蜂消化道内的,pH,基本一致，因而,对叶蜂有明显的致病作用,。提纯后接种于家蚕不会引起中毒。,（,2,）,-,外毒素,亦称苏云金素，又称热稳定外毒素，经,120,处理,10min,仍不会破坏。对直翅目、等翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和双翅目等,6,种昆虫、数种螨类和绒虫具有毒杀作用。,（,3,）,-,外毒素,是一种未经鉴定的酶类，能使卵黄琼脂澄清，其毒力尚未证实，但对蚕无毒。,（,4,）不稳定外毒素,对叶蜂科幼虫有毒性。毒性物质很不稳定，对空气、阳光、氧（较高的）、温度（,60,以上经,10,15min,）敏感而易遭到破坏，所以叫不稳定外毒素。毒素含有,17,种氨基酸；由一或数个低分子量肽链所组成。,（,5,）水溶性毒素,用一定剂量处理家蚕，在,3hr,内家蚕中毒，停止进食，对外界刺激无反应，表现麻痹虚弱，其症状与食下,内毒素中毒相似，但血清学研究证明它与,内毒素没有关系。,（,6,）鼠因子外毒素,不耐热，具有蛋白质性质，对小鼠和几种鳞翅目昆虫有较强的毒性，致死剂量的毒素可以使小鼠延缓生长或延长发育期。,病 症,本病是桑蚕食下苏云金杆菌及其变种所产生的毒素而引起的，以大蚕期发病较多。因蚕儿食下晶体毒素量的多少，而分为,急性中毒,和,慢性中毒,两种。,急性中毒：蚕食下大量毒素后，经数十分钟乃至数小时内中毒死亡。往往前期症状不易被察觉而表现为突然停止食桑，前半身抬起（抬胸），胸部略膨胀（胸肿），呈苦闷状，有痉挛性颤动并伴有吐液，全身麻痹，腹脚失去抓着力而侧倒卒毙，卒倒病即由此而来。初死时体色尚无变化，手触尸体有硬块，后部空虚，有轻度尸僵现象，头部缩入呈勾嘴状，多数第,1,2,腹节略伸长。从症状出现到死亡时间，亦以食下毒素多少为转移，快者,30,分钟，慢者,3-4,小时，死后一天左右，从第,1,、,2,腹节开始变黑腐烂，很快扩展人躯，终于腐败液化。,慢性中毒：蚕食下亚致死剂量毒素时，呈慢性中毒。初期表现为食欲减退，从少食桑叶到食桑停止，体躯生长极度迟缓，体色较暗，头胸稍肿，并有缩皱，渐而全身萎缩。小肠以下空虚，排不正形粪，有时排出红褐色污液。濒死时，体色暗黄，间有吐液，肌肉松弛，麻痹，背管搏动缓慢，匍伏于桑叶面上，手触蚕体柔软，倒卧而死。本病蚕的尸体初呈现水渍状病斑，渐次变褐而腐烂，流出黑褐色污液。如果蚕食下临界亚致死剂量毒素时，也会表现中毒症状：突然停止食桑，有轻微的痉挛性颤动，上半身空虚，行动呆滞，但经过一段时间病理反应后，可恢复食桑，体色也会渐次恢复正常，但此后体躯瘦长，发育明显比正常蚕慢，入眠及上簇均比正常蚕推迟,13,天，但最终蚕体发育和茧质与正常蚕无大差异,病变及致病过程,-,内毒素作为伴孢晶体亚单位存在时是无毒的,，经溶解或蛋白酶水解时才变成有毒的多肽。伴孢晶体被桑蚕食下后，在中肠被强碱性的胃液溶解，释放出,13000,145000Da,的晶体蛋白，再被蛋白酶水解而激活，被激活的毒素分子量为,50000-70000Da,。蛋白酶水解激活的过程包括去掉原毒素的,C-,末端部分。用,3H-,亮氨酸标记的,-,内毒素添食于桑蚕，仅,5min,即可在血液中检测到放射性的毒素碎片，说明伴孢晶体在蚕消化道中溶解、分解和吸收都是十分迅速的。,-,内毒素引起蚕体生理病理变化主要是：,-,内毒素进入中肠被溶解和激活后，首先结合到靶细胞上的膜受体，然后毒素分子进入膜内，在膜上产生小孔，小孔半径为,0.6-0.1nm,，形成渗透通道，最终导致,膜的胶样渗透溶解,，细胞因胶样渗透平衡的破坏而死亡。有研究认为，鳞翅目幼虫细胞膜上的受体是高度专一的糖蛋白。,苏云金杆菌的生产,苏云金杆菌的生产方式有两种，即液体法和固体法，目前大部分是采用液态深层发酵，工艺成本高，投资强度较大。采用固体发酵，不仅可以降低生产成本，提高产品的毒杀效果，而且方法容易掌握，产品易储存、好运输。,一、液体深层发酵,苏云金杆菌类生产工艺及培养基配方虽可有异，但生产过程基本上是相似的。武汉微生物农药厂生产青虫菌,(,蜡螟变种,),的工艺方法大致如下。,砂土管菌种,茄瓶斜面,无菌空气种子罐培养基,发酵罐,发酵液,填充罐轻质碳酸钙,过滤滤液弃去,调浆罐滤饼,菌浆加展着剂喷雾干燥菌粉质量检查成品,种子罐培养,是为扩大生产繁殖足够数量的健壮而纯洁的种子,发酵罐培养,是细菌大量繁殖并形成芽孢和晶体的阶段,二、半固体发酵,苏云金杆菌类半固体发酵目前常用的方法有三级扩大培养和一步扩大培养等。,(,一,),三级扩大培养,生产工艺流程砂土管菌种,斜面菌种,液体种子,扩大培养,半固体浅盘培养,干燥粉碎包装。,(,二,),一步扩大培养,采用半固体浅盘发酵，但以工业生产的菌粉作为种子，省略了斜面菌种和种子扩大培养两个步骤。将灭菌过的半固体培养基倒在消毒过的塑料薄膜上，用质量高的工业菌粉,(,每克含活芽孢,100,亿,),按配料干重的,1,量抢温接种,(,培养基温度可在,80,),，拌匀后用塑料薄膜包起热闷,10,分钟，以达减少杂菌和催芽目的。然后打开塑料膜摊放在浅盘上培养。其他步骤与三级扩大培养法同。,三、细菌性中毒病发病规律,卒倒杆菌及毒素通过污染桑叶，经口食下传染。而高温多湿的条件，有利于病原细菌的传播与蔓延。,（一）传染来源,卒倒杆菌是兼性寄生菌，除可寄生于活体外，还可在死体及腐殖质上大量繁殖，而且可以广泛存在于土壤及水等场所中。主要传染来源有桑园害虫如桑尺蠖、桑盗毒蛾（桑毛虫）、桑螟、桑蟥及其他野外昆虫均可感染卒倒杆菌，其排泄物及尸体均能污染桑叶而传染蚕；蚕沙处理不当或水源不洁，患本病的蚕尸体及排泄物散落在蚕室、蚕具或用作地面育的表土上，都可引起感染；与蚕区相间的棉田或稻田施用细菌农药（如青虫菌、杀螟杆菌等）而处理不当，或把施用过细菌农药的稻草挪作养蚕用时，将是直接引起本病的主要原因。,（二）蚕座内传染,病蚕排泄物及尸体流出的污液是蚕座传染的主要来源。蚕食下卒倒杆菌的菌体及毒素引起急性中毒发病死忙，根据卒倒杆菌的生物学特性，此期间体内或排出的毒素很少甚至没有，因此不能致病或致病力很弱。但在潮湿的蚕座上经一定时间后，便可形成大量的芽孢及毒素，则致病力大为加强。,（三）环境因素,高温多湿是本病发生的重要原因。阴雨多，温度大，排湿困难，特别是连续喂食湿叶的情况下，造成蚕座潮湿、蒸热，有利于病菌的繁殖和传播而不利于蚕的健康，容易大量发生细菌性中毒病。,四、细菌性中毒病的诊断,（一）肉眼鉴定,本病前期症状不易被察觉，只是表现为突然停止食桑，胸部略膨胀，有痉挛性颤动，刚死时体色无变异，死后受触尸体有硬块，头部缩入呈勾嘴状，胸部略膨大，第,12,腹节略伸长，有轻度尸僵现象是其明显的特征。,（二）显微镜检察,取病蚕消化道内容物制成临时玻片标本，镜检可观察到大量大型杆菌及芽孢，但必须检到伴孢晶体才能确诊。遇病蚕急性中毒在短时间内死忙，不易检到芽孢及晶体时，可将病蚕尸体放置一定时间后再行观察。检察方法是：将临时标本涂片后作热固定，用,1%,结晶紫或石炭酸复红染色，在油镜下可看到营养菌体及伴孢晶体着色较深，而芽孢则不易着色，可资鉴别。,（三）生物鉴定,将病蚕尸体放置一定时间后，加无菌水研磨，将上清液添食于蚁蚕（或小蚕），如引起急性中毒即可确诊。有条件时可将病蚕消化道内容物进行细菌分离培养，从分离的菌落中检查有无芽孢及伴孢晶体。必要时可将之添食于蚁蚕，如引起急性中毒病，即可确诊。,产品,苏云金杆菌杀虫剂,项目单位,：,中科院武汉病毒研究所,项目内容,：,该杀虫剂有粉剂、乳剂两种，对人畜安全无毒，是一种广谱性的生物杀虫剂，可杀鳞翅目昆虫和小菜蛾、斜纹夜盗蛾、粘虫、鞘翅目昆虫、星飘虫、柳兰叶甲、黄粉甲等。苏云金杆菌杀虫粉剂效价每毫克,1.6,万国际单位，杀虫效果与化学农药相当。,市场前景,：,该品为生物农药，高效、低毒、无污染，是生产绿色无公害食品的理想农药，符合农药的发展方向，市场前景广阔。,总投资额,：,800,万元,预期效益,：,年利润,100,万元。,合作方式,：,技术转让，联合开发。,