第05章-分子发光.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子发光,Molecular Luminescence,分子荧光,分子磷光,化学发光,生物发光,散射光谱,光致发光,：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。,化学发光,：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。,目 录,5-1 荧光和磷光光谱法,5-1-1 基本原理,5-1-2 荧光分析仪器,5-1-3 荧光分析方法的特点与应用,5-1-4 磷光分析法,5-2 化学发光与生物发光分析法,5-2-1 基本原理,5-2-2 发光反应的类型与应用,荧光（,fluorescence,）现象的第一次记录：,1575年，西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，观察到Lignum Nephriticum木头切片的水溶液呈现天蓝色。,第一次被提议用于分析：,1864年，Stokes,第一次用于分析：,1867年，Goppelsrder根据,Al-桑色素配合物的荧光，建立,了Al,3+,的荧光测定方法。,George Gabriel Stokes(1819-1903),参考文献：,陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊,本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990,Joseph R.,Lakowicz,Principle of Fluorescence,Spectroscopy,Kluwer,Academic/Plenum Publishers,New York,1999,netLibrary,电子图书,2分子内的光物理过程,辐射跃迁：,荧光：S,1,最低振动能级S,0,磷光：ST,非辐射跃迁,：,振动弛豫,内转移,外转移,系间窜跃,非辐射能量传递过程,振动弛豫：,同一,电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10,-12,s。,内转换：,同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。,通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。,外转换：,激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；,外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,系间窜跃：,不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。,改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。,辐射能量传递过程,荧光发射,：电子由,第一激发单重态的最低振动能级基态，多为,S,1,S,0,跃迁,，发射波长为,2,的荧光；10,-7,10,-9,s。,由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；,2,2,1,；,磷光发射：,电子由,第一激发三重态的最低振动能级基态，,T,1,S,0,跃迁；,电子由,S,0,进入,T,1,的可能过程：（,S,0,T,1,禁阻跃迁）,S,0,激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫,T,1,发光速度很慢：10,-4,100 s。,光照停止后，可持续一段时间。,5-1-1-2 光谱曲线,激发 ex max,发射 em max,磷光（,phosphorescence,）,特征：,（1）Stokes位移,（2）ex一般不影响em sp的形状,（3）吸收光谱与em sp的镜像关系,激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes,位移,激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。,b.发射光谱的形状与激发波长无关,电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图,2,1,)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如,2,)。,c.镜像规则,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然,。,5-1-1-3 荧光的影响因素,1.分子产生荧光必须具备的条件,（1）具有合适的结构；,（2）具有一定的荧光量子产率。,量子产率:,荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之比（当非辐射跃迁,A,返回基态的概率很小时，,F,接近于,1,，在通常情况下，,F,总是小于,1,的）2荧光与有机化合物的结构,（1）跃迁类型：,*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；,（2）共轭效应：,提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移,（3）刚性平面结构：,可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,（4）取代基效应：,芳环上有供电基，使荧光增强。,3荧光与金属螯合物,(1)配体发光,荧光弱荧光强,(2),金属发光,Mn(II)d*d,4溶剂效应,同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。,一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。,5 温度的影响,一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。,如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。,碰撞,能量转移,O,2,的作用(光漂白),自熄灭、自吸收,(,内滤效应,),6荧光熄灭（猝灭）,Fluorescence spectra(,-)of TPP and absorption spectra(-)of ETH5294 in plasticized PVC membrane:a.Excitation spectrum of TPP;b.Emission spectrum of TPP;c.Unprotonated ETH5294;d.Protonated ETH5294.,荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。,5-1-1-4 荧光强度的定量关系,k,与仪器有关的常数,I,0,激发光的强度,F,荧光量子产率,荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数,l,光程长度。,根据,Parker,方程，荧光强度,F,与荧光物质的浓度,c,之间的关系是：,当,cl,项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，,Parker,方程可简化为：,19,世纪前,肉眼观察,1928,年,Jette,，,West,发明光电比色计,1939,年,应用光电倍增管（,PMT,）,1952,年,商品化校正光谱仪器,1980,年后,计算机化,5-1-2 荧光分析仪器,5-1-2-1 荧光分析仪器框图,光源,激发单色器,样品池,发射单色器,检测器,信号处理,显示,I,0,F,I,1,5-1-2-2 荧光分光光度计部件,理想的荧光分析仪器?,1,光源：,钨灯、汞灯、氙灯、激光,激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。,2,单色器：,滤光片、光栅,激发单色器和发射单色器,3,检测器,PMT Photomultiplier,CCD,Charge Coupled Device,CID,Charge Injected Device,4,信号处理,HITACHI,Fluorescence Spectrophotometer F-4500,Features,Three dimensional contour plots,Phosphorescence,In addition to fluorescence and phosphorescence measurements luminescence is included as standard.,The intense 150 watt xenon source provides maximum light energy over the entire 200-900 nm wavelength range of the spectrophotometer.,Our unique horizontal beam geometry of the excitation and emission beams increases sensitivity and requires only 0.6,mL,of sample in a standard 10mm,cuvette,.,灵敏度高：,比紫外-可见分光光度法高24个数量级；检测下限：0.10.1ug/cm,-3,相对灵敏度：005-0.005ppb（0.05M H2SO4),选择性高,重现性好,取样量少,仪器不复杂,5-1-3 荧光分析方法的特点及应用,1特点,2应用,检测：金属离子、有机物、生物分子,生物分子相互作用研究,疾病诊断,（参见附件）,定性分析：,依据,不同结构,的物质所,发射的荧光波长不同,；,定量分析,：同种物质的稀溶液，其产生的,荧光强度与浓度呈线性关系。,5-1-4 磷光分析法,1如何获得较强的磷光,增加试样的刚性:低温冷冻,固体磷光法：吸附于固相载体（滤纸）,分子缔合物的形成：加入表面活性剂等,重原子效应：加入含重原子的物质，如银盐等,敏化磷光：通过能量转移产生磷光,磷光发射：,电子由第一激发三重态的最低振动能级,基态，,T,1,S,0,跃迁；,电子由,S,0,进入,T,1,的可能过程：（,S,0,T,1,禁阻跃迁）,2磷光分析仪器,荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。,液槽,斩波片,测量方法：,（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。,（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。,室温测量时，不需要杜瓦瓶。,3.应用,稠环芳烃和石油产物,采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表,农药、生物碱、生长激素,烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析,检测限0.01u,g/cm,-3,药物分析,见表,5-2 化学与生物发光分析法,5-2-1 基本原理,1.化学发光反应,（,Chemiluminescence,）,在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。,A +B,C +D*,D*D+,h,（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；,（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当,E,=170300 kJ/mol；位于可见光区；,（3）,发光持续时间较长，反应持续进行；,化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（,bioluminescence,）。,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：时刻,t,的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,d,c,/d,t,分析物参加反应的速率；,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，,对于一级动力学反应：,d,c,/d,t,=,Kc,；,K,为反应速率常数。,定性依据：,（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）,在一定条件下，,曲线下面积为发光总强度(,S,)，其,与被测物浓度成线性：,4.装置与技术,装置流程：,发光反应室,光检测器,信号放大器,显示与记录,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：,静态方式,：,用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量试样量小，重复性差；,流动注射方式,：,用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,5.特点,灵敏度极高,例：荧光素酶和磷酸三腺甙,(ATP),的化学发光分析，可测定,2,10,-17,mol,/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量,仪器设备简单,不需要光源、单色器和背景校正；,发射光强度测量无干扰,无背景光、散射光等干扰；,线性范围宽,分析速度快,缺点：,可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,5-2-2 发光反应的类型与应用,1,.,气相化学发光反应,用于大气中O,3,、NO、NO,2,、H,2,S、SO2,、CO等组分的监测。,a.,一氧化氮与O,3,的发光反应,NO +O,3,NO,2,*NO,2,*NO,2,+,h,发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm,-3,；,b.氧原子与SO,2,的发光反应,O,3,O,2,+O（1000,C石英管中进行,）,SO,2,+O+O SO,2,*+O,2,SO,2,*SO,2,*+,h,最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm,-3,；,O,3,O,2,+O（1000,C石英管中进行,）,NO +O NO,2,*,NO,2,*NO,2,+,h,发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/cm,-3,；,d.氧原子与CO的发光反应CO +O CO,2,*,CO,2,*CO,2,+,h,发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm,-3,；,c.,氧原子与NO的发光反应：,e.,乙烯与O,3,的发光反应,乙烯与O,3,反应，生成激发态乙醛：,CH,2,O*,CH,2,O,+,h,最大发射波长：435nm；对,O,3,的特效反应；线性响应范围1 ng/cm,-3,1g/cm,-3,；,f.火,焰中的化学发光反应：,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；,一氧化氮,NO +H HNO*,HNO,*HNO +,h,发射光谱范围：660770nm；,最大发射波长：690nm；,在,富氢火焰中：,NO,2,+2H NO+H,2,O,该反应十分迅速；,硫化物,挥发性硫化物,SO,2,、H,2,S,、CH,3,SH、CH,3,SCH,3,等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：,SO,2,+2H,2,S +2H,2,O,S +S 2S,2,*,S,2,*S,2,+,h,发射光谱范围：350460nm；,最大发射波长：394nm；,灵敏度：0.2 ng/cm,-3,；,发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,2.液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H,2,O,2,、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。,应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；,化学发光反应效率：0.150.05；,鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,鲁米诺,-,H,2,O,2,发光反应可检测低至,10,-9,mol/L,的,H,2,O,2,；,鲁米诺,-,H,2,O,2,发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的,Cu,2+,、,Mn,2+,、,Co,2+,、,V,4+,、,Fe,2+,、,Fe,3+,、,Ni,2+,、,Ag,+,、,Au,3+,、,Hg,2+,等,通过测定生成的,H,2,O,2,，间接测定某些生物试样，如确定,氨基酸、葡萄糖,含量。,氨基酸 +O,2,酮酸 +NH,3,+H,2,O,2,氨基酸氧化酶,葡萄糖 +O,2,+H,2,O,葡萄糖酸 +H,2,O,2,葡萄糖氧化酶,草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,3.生物发光（Bioluminescence）,生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。多种细菌、昆虫、鱼类等均能发光。可用于环境质量监测。,仿佛地球的迅速旋转，将黑色的大气擦出了火；仿佛风在赶动这具行星磨石，从磨石边上迸出这种瞬息间的火花来。,汤玛斯罗维尔贝多士 1824年意大利米兰,生物发光原理：在生物发光分析中，通常同时涉及到酶促反应和发光反应。在pH为7-8的介质中，在荧光虫素酶（E）和Mg(II)离子的存在下，荧光虫素（LH,2,）与ATP反应，生成磷酸腺苷（AMP）荧光虫素和荧光虫素酸的复合物及镁的焦磷酸盐（ppi）。其反应如下：,ATP+LH,2,+E+Mg,2+,pH=7-8,AMPLH,2,E+Mgppi+2H,+,然后复合物与氧反应，发生化学发光反应：,AMPLH,2,E+O,2,氧化荧光虫素*+AMP+CO,2,+H,2,O,氧化荧光素*氧化荧光素+,hv,（,max,=562nm）,ATP,的测定,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg,2+,的存在下，荧光素(LH,2,)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP +LH,2,+E+Mg,2+,AMP,LH,2,E+Mg ppi+2H,+,pH7-8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP,LH,2,E+O,2,氧化,荧光素,*,+AMP+CO,2,+,H,2,O,氧化,荧光素,*氧化,荧光素,+,h,最大发射波长562nm；,NADH,的测定,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：,NADH,+FMA+H,+,NAD,+,+FMNH,2,NADH脱氢酶,FMNH,2,RCHO+O,2,FMN+RCOOH+H,2,O+,h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,4.电化学发光/电致发光,在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。,例如：,发光剂钌吡啶Ru(bpy),3,2+,和电子供体三丙胺TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的Ru(bpy),3,2+,被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA,+,，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA,，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的Ru(bpy),3,3+,，使其形成激发态的Ru(bpy)3,2+,，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的Ru(bpy),3,2+,发射出波长,620nm的光子。该过程可在电,极表面周而复始地进行。,电化学发光免疫测定,（,Electrochemiluminescent,immunoassay,ECLIA,）,电化学发光免疫测定是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（,ECL,）和免疫测定相结合的产物。它的标记物的发光原理与一般的化学发光（,CL,）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。,ECL,与,CL,的差异在于,ECL,是电启动发光反应，而,CL,是通过化合物混合启动发光反应。,ECL,不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于,DNARNA,探针检测。,以人血清促甲状腺激素 THS检测为例,三联吡啶钌衍生物,Ru(bpy),3,2+,标记的,TSH,抗体和结合了生物素的,TSH,抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育,9,分钟。,2 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。,3蠕动泵将形成的 Ru(bpy),3,2+,抗体抗原抗体磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与Ru(bpy),3,2+,结合的抗体）也被吸出测量室。,4蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。,5最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。,附录：发 光 原 理,荧光灯,：当高压加在灯管两端后，灯管内少数电子高速撞击电极后产生二次电子发射，开始放电，管内的水银受电子撞击后，激发辐射出,253.7nm,的紫外光，产生的紫外光激发涂在管内壁上的荧光粉而产生可见光。（可见光的颜色将依据所选用的荧光粉的不同而不同）,人体里有很多磷，据测定，约有一千克左右。不过，这许多磷既不是白磷，也不是红磷，而是以磷的化合物的形式存在于人体。骨头中含磷最多，因为骨头的主要化学成分便是磷酸钙。在人的脑子里，也有许多磷的化合物磷脂。在人的肌肉。神经中，也含有一些磷。动物骨头的主要成分，也是磷酸钙。在坟地或荒野，有时在夜里会看见绿幽幽或浅蓝色的“鬼火”。原来人、动物的尸体腐烂时，身体内所含的磷分解，变成一种叫做磷化氢的气体冒出；磷化氢有好多种，其中有一种叫“联膦”，它和白磷一样，在空气中能自燃，发出淡绿或浅蓝色的光,这就是所谓的“鬼火”,。,荧光棒,中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。,萤火虫,发光的过程与萤火虫体内特殊物质的综合作用有关。它是由生物体内细胞新陈代谢的重要物质腺苷三磷酸（ATP）引起的，这种物质使一种叫作虫荧光素的特殊的发光物质活跃起来。被ATP激活后，虫萤光素又被体内的一种酶（虫荧光素酶）和通过稠密的导管进入体内的空气中的氧所氧化。,这种氧化反应导致兴奋状态而发,光，然后，光又经多脂肪细胞的下层,反射出来。,