基因工程57.ppt

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Technique,重组,DNA,技术即基因工程，是对携带遗传信息的分子,DNA,，进行设计和改造的工程，包括基因重组、克隆和表达,重组,DNA,技术的发展史,年,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验,1973,年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组,DNA,分子,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工厂,1997,年 英国罗斯林研究所成功的克隆了多莉,一、重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合,技术水平：,分子克隆,(molecular clone),即,DNA,克隆，,基因克隆,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,原意是指一个拷贝,(copy),多利档案,在微电流刺激下，白绵羊的细胞核与黑脸羊的无核卵子融合到一起，开始分裂、发育，成为胚胎，植入另一只母羊的子宫里继续发育。在,277,个成功与细胞核融合的卵子只有,29,个存活下来，被移植到,13,头母羊体内。移植手术后,148,天，,1996,年,7,月羊羔诞生了,1,277,，其他的都失败了,将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的,DNA,，即,目的基因,）分离出来，并应用酶学的方法，在,体外切割,目的基因和载体,DNA,，并,连接,成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过,转化或转染,宿主细胞，,筛选,出含有目的基因的转化子细胞，再进行,扩增,或扩增并表达,获得大量同一,DNA,或蛋白质分子,，也称基因克隆或重组,DNA(recombinant DNA),DNA,克隆相关概念,DNA,克隆,工具酶,目的基因,基因载体,基本原理,重组,DNA,技术与医学的关系,本章主要内容,目的：,分离获得某一感兴趣的基因或,DNA,获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,(genetic engineering),实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,基因工程常用工具酶,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,连接,DNA,片段,DNA,聚合酶,合成双链,DNA,逆转录酶,以,RNA,为模板合成,cDNA,限制性核酸内切酶,定义,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护自身,DNA,分类,、,、,（基因工程技术中常用,型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写,第四个字母代表株,用罗马数字表示发现的先后次序,命名,H,in,d,属,种,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,主要来源于原核生物,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),GG,A,T,CCCC,T,A,GG,特点：呈二元旋转对称,舟行水面水行舟,5 GTT,AAC3,Hpa,I 5 GTT AAC3,3 CAA,TTG5 3 CAA TTG 5,切割：,以内切方式水解双链,DNA,中的磷酸二酯键，产生的,DNA,片段,5,端为磷酸基，,3,端为羟基,类酶切割双链,DNA,产生,3,种,不同的切口,：,1,、在,对称轴中心,同时切割双链，产生,平末端,或称钝性末端（,blunt end,），如,Hpa,I,：,5 G,AATT C3,Eco,R I 5 G AATTC3,3 C TTAA,G5 3 CTTAA,G 5,5,5,5 C TGCA,G3,Pst,I 5 CTGCA G3,3 G,ACGT C5 3 G ACGTC 5,3,3,2,、在,对称轴两侧相对位点,分别切割一条链。靠近,5,端,切割产生,5,端突出的粘性末端,，如,Eco,RI,：,3,、靠近,3,端,切割产生,3,端突出的粘性末端,。如,Pst I,：,5 ATCGC,GATTA3,请问产生的是何种末端？,同尾酶*,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍末端,(compatible end),Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,（三）目的基因,例如：获取胰岛素原、干扰素、乙肝病毒抗原、,SARS,病毒抗原等表达基因，用于防治人类多种疾病,获取方法：采用人工合成、基因组,DNA,文库和,cDNA,文库筛选、以及,PCR,扩增的方法,HBV,HIV,感兴趣的基因,（四）基因载体,定义,为携带目的基因，实现其复制或表达时所采用的一些,DNA,分子,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,按得到的产物，载体可分为,克隆载体（,cloning vector,）,主要用于目的基因的扩增的载体,表达载体（,expression vector,）,用于获得目的基因编码的蛋白质,1.,质粒plasmid),概念,存在于细菌染色体外的小型双链共价闭合环状,DNA,分子，其能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状,pBR322,质粒图谱,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,多克隆位点,较早构建的克隆载体,卡那霉素,抗性基因,乳糖操纵子,多克隆位点,表达载体,pET28a,克隆载体,pUC18/19,-,互补,：单独存在的,-,及,-,片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（,X-gal,）变为,蓝色化合物,突变型,lac,-,E.coli,（如,E.coli,DH5,、,E.coli,JM109,等）只能表达,-,半乳糖苷酶的,-,片段,如果插入的外源基因是在,lacZ,基因内，就会影响,lacZ,的表达，利用,lac,-,E.coli,为宿主细胞，在含,X-gal,的培养基上生长时会出现,白色菌落,；若无外源基因插入，则出现,蓝色菌落,编码,-,半乳,糖苷酶的,-,片段,多克隆位点,Review,：乳糖操纵子的结构,调控区,CAP,结合位点,启动序列,操纵序列,结构基因,Z,：,-,半乳糖苷酶,Y,：透酶,A,：乙酰基转移酶,Z,Y,A,O,P,DNA,I,调节基因,2,、噬菌体,(phage),是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的,病毒,的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体,噬菌体,常用的噬菌体载体,噬菌体,DNA,，为线性双链,DNA,，它的两端各有,12,个碱基的互补粘性末端，称,COS,位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。,DNA,在体外可包装成病毒颗粒，并能高效感染大肠杆菌,左臂,20kb,右臂,9kb,中间区,14kb,COS,位点,COS,位点,5,3,Sal I,BamH II,EcoR I,EcoR I BamH II Sal I,噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以被外源性,DNA,取代,外源性,DNA,M,13,噬菌体载体,M,13,噬菌体基因组是,单链环状,DNA,，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链环状,DNA,转变成复制型双链环状,DNA,，可提取出来作为基因载体,1977,年，,Messing,等根据,-,互补原理,构建了质粒克隆载体,pUC,系列，可以直接利用显色法直接筛选（蓝白斑实验）；经改造的,M13,噬菌体载体系列也由,Messing,等构建，具有与,pUC,系列相对应的,-,互补现象,各种载体所能容纳的外源片段的大小,质粒载体：,5,kb,噬菌体载体：,22,kb,粘粒（,cos,质粒，柯斯质粒）：,40-50,kb,酵母人工染色体载体（,YAC,）：,200-300,kb,Review,：基因载体,定义,为携带目的基因，实现其复制或表达时所采用的一些,DNA,分子,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,二、,DNA,重组的基本原理,1,、目的基因的获取,2,、基因载体的选择与构建,3,、目的基因与载体的拼接,4,、重组,DNA,分子导入宿主细胞,5,、筛选并繁殖含重组分子的受体细胞,6*,、克隆基因的表达,粘性末端,质粒,目的基因,粘性末端,匹配的粘性末端,酶切后的目的基因片段,接,(,连接,),连接后的重组质粒,DNA,分子,重组质粒,目的基因,大肠杆菌,转,(,转化,),染色体,真好玩,!,筛,(,筛选,),分解抗生素的酶,含抗生素的培养基,还活着,!,玩完啦,!,大肠杆菌大肠杆菌,大量生长,提取大量,质粒,酶,切,鉴定,重组,DNA,的操作步骤,P360,分,分离出目的基因及载体,DNA,切,利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因,和载体,接,利用连接酶将目的基因与载体,DNA,共价连接,形成重组,DNA,分子,转,重组,DNA,分子转化宿主细胞,筛,筛选和鉴定含有重组,DNA,分子的宿主细胞,（阳性克隆）,（一）分,分离出,目的基因,及,载体,DNA,1,、目的基因的获取,化学合成法,基因组,DNA/cDNA,文库筛选,聚合酶链反应,(PCR),(1),化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列可能存在的问题？,适用于,：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的,氨基酸序列，合成的基因一般较短,化学合成法,合成的基因一般较短，多为活性肽类基因，如人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等,基因文库,(gene library),指包含了某一生物体全部,DNA,序列的克隆群体,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),cDNA,文库,(cDNA library),(2),基因文库筛选,基因组,DNA,文库是指生物的,基因组,DNA,的信息（包括所有的编码区和非编码区）以,DNA,片段形式贮存的克隆群体,用于构建基因组文库的载体有,噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等,gDNA,文库,利用,限制性核酸内切酶,将染色体,DNA,切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组,DNA,分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带,一种,重组,DNA,分子的多个拷贝,这样全部转化细菌所携带的,各种染色体片段,就代表了染色体的整个基因组。,基因组,DNA,基因片段,重组,DNA,分子,重组子,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体,DNA,限制酶部分消化,外源,DNA,与载体,DNA,混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA,片段,cos L,R cos,20 Kb,外源,DNA,片段,基因文库,目 录,cDNA,文库,把细胞,总,mRNA,通过逆转录合成,总,cDNA,，再与适当载体连接后,转入受体菌,，从而得到含有某种生物体,全部,cDNA,的集合,，称为,cDNA,文库（,cDNA library,）,特点：,1,、代表了细胞 在取材当时所表达基因的总和，,不包括那些未表达的基因,。,2,、,mRNA,分子中,不包括内含子及调控序列,，所以,cDNA,文库的复杂性要比基因组文库低的多。,基因工程中,获取目的基因的重要方法,之一,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链,Review,：,人工合成,cDNA,（,complementary DNA,）,cDNA,文库,基本原理,：在体外模拟体内的,DNA,复制,PCR,体系,模板,DNA(template),寡核苷酸引物,(primer),单脱氧核苷酸,(dNTP),DNA,聚合酶,(polymerase),合适的缓冲液,(buffer),系统,特点：在体外高效、快速、特异地扩增目的基因或,DNA,片段的技术,(3),聚合酶链反应,PCR,Polymerase Chain Reaction,PCR,过程,变性,(denaturation)DNA,双链解链变为单链,退火,(annealing)DNA,复性，引物与模板结合,延伸,(extension),引物沿,53端延伸合成新链,此基本反应步骤为,1,个循环,(cycle),25-35,个循环,2,10,=1024 10,3,；,2,20,=1048576 10,7,；,2,40,10,14,1 mol=10,3,mmol=10,6,mol,=10,9,nmol=10,12,pmol,模板,DNA,产物,DNA,10 cycles,20 cycles,40 cycles,1 pmol,1 nmol,10,mol,100 mol,PCR,发明者,Mullis,1,）逆转录,PCR,技术,*,几种重要的,PCR,衍生技术,逆转录,PCR,(reverse transcription PCR,，,RT-PCR),是将,RNA,的逆转录反应和,PCR,反应联合应用的一种技术。,RT-PCR,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的,RNA,进行定性及半定量分析的最有效方法。,2,）原位,PCR,技术,原位,PCR,(in situ PCR),是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的,PCR,反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测,DNA,或,RNA,是否在该组织或细胞中存在。,原位,PCR,方法弥补了,PCR,技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。,3,）实时,PCR,技术,实时,PCR,(real-time PCR),技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量,PCR,。,实时,PCR,技术原理,目 录,克隆载体的选择和构建,载体的选择标准,能自主复制,具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定,有克隆位点（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点,分子量小，以容纳较大的外源,DNA,在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代,（二）切,利用,限制性核酸内切酶,分别切割目的基因和载体,5 XXXGAATTCXXX 3,3 YYYCTTAAGYYY 5,切割：以内切方式水解双链,DNA,中的磷酸二酯键，,产生的,DNA,片段,5,端为磷酸基，,3,端为羟基,5 XXXG 3,3 YYYCTTAA 5,5 AATTCXXX 3,3 GYYY 5,粘性末端连接,平端连接,同聚物加尾连接,人工接头连接,（三）接,用,连接酶,将目的基因与载体,DNA,连接成重组,DNA,分子,1.,粘性末端连接,DNA,连接酶,“缝合”基因的“分子针线”,日常工作中常用的是来源于,T4,噬菌体的,T4,DNA,连接酶，需要供能,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,4-22C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,目的基因自连,(n,聚体,),载体自连,(n,聚体,),单一限制酶切位点连接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,4-22C,配伍末端的连接,AGATCT,TCTAGA,+,A,GATCT,GATCT,A,GATC,GATC,A,GATCT,GATCT,A,GATC,GATC,Bgl,切割反应,双酶切位点的连接,Eco,R,切割位点,G,AATTC,CTTAA,G,A,GATCT,TCTAG,A,G,G,CTTAA,AATTC,A,TCTAG,GATCT,A,Bgl,切割位点,T4,DNA,连接酶,4C,G,CTTAA,A,TCTAG,AATTC,G,GATCT,A,重组体,实际工作中最常采用的方法,AATTC,G,A,TCTAG,AATTC,G,GATCT,A,AATTC,G,A,TCTAG,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,平端连接,平头末端也可以用,T4 DNA,连接酶连接，只是效率低，需要的酶浓度和,ATP,更高,在,末端转移酶,作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列，如将,poly,（,dC,）加到双链,DNA,片段,3,羟基上，而将,poly,（,dG,）加到质粒载体,3,羟基上，制造出,粘性末端,，然后通过,退火,进行粘性末端连接,3.,同聚物加尾连接,人工接头（,linker,）是指人工合成的一段,双链寡核苷酸,，其中包含一个（或两个）,酶切位点,。首先将接头与目的,DNA,片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接,4.,人工接头连接,安全宿主菌,受体菌条件,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),转化,(transformation),导入方式,转染,(transfection),感染,(infection),（四）转,重组,DNA,导入,受体菌,基因片段（特别是纯化的,DNA,）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在低温条件（冰浴）下，用,CaCl,2,处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“,感受态细胞,competent cell,）,在分子克隆中，以质粒为载体构建的重组分子导入原核细胞的过程称为,转化,（,transformation,）,以噬菌体、病毒等作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为,转染,（,transfection,）,（五）筛,筛选和鉴定含有重组,DNA,分子的宿主细胞,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),(3),分子杂交法,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶联免检测分析等,(,插入失活法,),抗药性标记选择,目 录,重组子,重组子,非重组子,非重组子,非重组子,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,目 录,当外源基因插入后，,LacZ,基因被破坏，不能组成有活性的,-,半乳糖苷酶，因此不能分解底物,X-gal,，菌落成,白色,-,半乳糖苷酶能分解,X-gal,，形成,蓝色,菌落,蓝白斑筛选实验,指用,探针,检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来,核酸分子杂交（,molecular hybridization,）,探针,(probe),一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在,分子杂交实验,目 录,基因芯片,P489,目 录,放射自显影照片,目 录,印迹技术（,Blotting,）,P481,（一）,DNA,印迹技术,(Southern blotting),用于基因组,DNA,、重组质粒和噬菌体的分析,（二）,RNA,印迹技术,(Northern blotting),用于,RNA,的定性定量分析,（三）蛋白质的印迹分析,(Western blotting),用于蛋白质定性定量及相互作用研究,（五）筛,筛选和鉴定含有重组,DNA,分子的宿主细胞,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),(3),分子杂交法,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶联免检测分析等,安全宿主菌,受体菌条件,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),转化,(transformation),导入方式,转染,(transfection),感染,(infection),（四）转,重组,DNA,导入,受体菌,粘性末端连接,平端连接,同聚物加尾连接,人工接头连接,（三）接,用,连接酶,将目的基因与载体,DNA,连接成重组,DNA,分子,（二）切,利用,限制性核酸内切酶,分别切割目的基因和载体,5 XXXGAATTCXXX 3,3 YYYCTTAAGYYY 5,切割：以内切方式水解双链,DNA,中的磷酸二酯键，,产生的,DNA,片段,5,端为磷酸基，,3,端为羟基,5 XXXG 3,3 YYYCTTAA 5,5 AATTCXXX 3,3 GYYY 5,（一）分,分离出,目的基因,及,载体,DNA,1,、目的基因的获取,化学合成法,基因组,DNA/cDNA,文库筛选,聚合酶链反应,(PCR),2,、载体基因的选择,您已经掌握,基因克隆,的主要步骤！,分,离目的基因和载体,DNA,用合适的内切酶,切,割上述两者，产生匹配的末端,连接酶连,接,目的基因和载体，形成重组,DNA,分子,重组,DNA,分子,转,入宿主细胞,筛,选有目的基因的阳性克隆,大量生长,克隆载体：获得大量目的,基因,表达载体：获得大量目的,蛋白,克隆基因的表达*,表达体系的建立,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,1.,原核表达体系,（,E.coli,表达体系最为常用）,标准：,选择标志、强启动子、翻译调控序列、多克隆位点、可控性,E.coli,表达体系的优点：,培养方法简便、迅速、经济、适合大规模生产,历史悠久,E.coli,表达体系的,不足：,不宜表达真核基因组,DNA,不能对表达的真核蛋白质进行翻译后修饰,很难表达大量可溶性蛋白，表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点操作技术难、费时、成本高,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系,酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,神话成现实,绿叶变为鲜花,利用基因重组技术生产,1,克蛋白质，成本只需,0.02-0.5,美元；而利用其它生产工艺则需要,800-5000,美元,目前利用下列转基因动物可以生产出人类蛋白质药物：,牛：,抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋白、乳铁蛋白、糖基转移酶、蛋白,C,等,山羊：,抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、组织纤溶原激活因子、单克隆抗体等,绵羊：,抗胰蛋白酶、凝血因子,、蛋白,C,猪：,凝血因子,、蛋白,C,、纤维蛋白原、血红蛋白,经济,效益,幽灵走上餐桌？,转基因食品,传统社会道德面临着,严重的困惑和挑战！,德国、法国、匈牙利科学家,2012,年,2,月,15,日在,应用毒理学,杂志联合发表论文：“我们对我们的发现感到非常惊讶。到目前为止，人们一直以为,Bt,蛋白几乎不可能对人类细胞有毒性作用。现在，必须组织进一步的调查，以便发现这些毒素如何影响细胞，以及是否应当对这些毒素与食品和饲料供应链中其他成分的综合作用予以考虑，,作为结论，这些实验表明,Bt,毒素以及草甘膦除草剂的风险被低估”,Cytotoxicity on human cells of Cry1Ab and Cry1Ac Bt insecticidal toxins alone or with a glyphosate-based herbicide,Recombination Technique and Medicine,第三节,一、疾病基因的发现与克隆,疾病基因发现的两个典型例子,:,脆性,X,综合征,Kallmann,综合征,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制,二、生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品,美国,Eli Lilly,公司于,1982,年首先利用重组,DNA,技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始,人类基因组计划的完成和重要病原体、微生物等基因组测序工作的完成，将促进基因诊断向临床应用的快速发展,三、基因诊断与治疗,基因诊断,直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法，现已发展成为一门独具特色的诊断学科,早期,是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法,目前,广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法,基因治疗的概念,腺苷脱氨酶,(ADA),缺乏的严重联合免疫缺陷,(SCID),遗传性单基因疾病,治疗基本步骤,1.,产前诊断,2.,携带者测试,3.,症候前诊断,4.,遗传病易感性,四、遗传疾病的预防,本章小结,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,表型筛选,酶切、,PCR,鉴定,菌落原位杂交,筛选,Review,限制性内切酶,常用的基因载体，载体最基本的性质,质粒是什么,目的基因的获取方法,基因克隆的主要步骤,PCR,技术的基本原理、操作步骤、反应体系及其应用,