医学紫外可见分光光度法N.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,紫外可见分光光度法N,第一节 概述,一、紫外-可见分光光度法,利用某些,物质分子,对,紫外-可见光,的,吸收,来进行分析测定的方法,波长？,吸收程度？,l,、,I,0,l,、,I,第一节 概述,一、紫外-可见分光光度法,利用某些,物质分子,对,紫外-可见光,的,吸收,来进行分析测定的方法,波长？,吸收程度？,l,、,I,0,l,、,I,二、紫外-可见吸收光谱,吸收光谱(曲线),吸光物质对光的吸收程度(,吸光度,)与,波长,间的,关系曲线,测量吸光物质对不同波长紫外-可见光的吸收程度(吸光度)，以波长为横坐标吸光度为纵坐标作图，得到的谱图称该物质的吸收光谱。,宽带光谱,第一节 概述,一、紫外-可见分光光度法,物质分子,对,紫外-可见光,的,吸收,二、紫外-可见吸收光谱,吸收光谱(曲线),吸光度,与,波长,间的,关系曲线,三、紫外-可见吸收光谱中的常用术语,l,max,吸光度最大的地方所对应的波长,能在紫外-可见光范围内产生吸收的基团,与生色团连接时，能使生色团的吸收峰向长波长方向移动的基团,化合物吸收峰向长波长方向移动的现象,化合物吸收峰向短波长方向移动的现象,化合物吸收强度增强的现象,化合物吸收强度减弱的现象,1.,最大吸收波长,5.其它,2.生色团和助色团,3.红移和蓝(紫)移,4.增色效应和减色效应,第二节 朗白-比尔定律,一、,Lambert-Beer,定律,当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。,k,与溶液性质、温度和入射光波长有关,二、,吸光系数,k,的单位与名称,c：g,L,-1,、,l：cm,a：L,g,-1,cm,-1,吸光系数,c：mol,L,-1,、,l：cm,e,：L,mol,-1,cm,-1,摩尔吸光系数,c：g(100mL),-1,、,l：cm,比吸光系数,第二节 朗白-比尔定律,一、,Lambert-Beer,定律,二、,吸光系数,吸光系数、摩尔吸光系数、比吸光系数,c,A,三、偏离,Lambert-Beer,定律的因素,吸光分子电荷分布间的相互作用,各种样品组分分子间的相互作用,如何避免？,样品对光的散射作用,1.与样品溶液有关的因素,稀溶液,真溶液,入射光为复合光,单色器性能,2.与仪器有关的因素,如何避免？,测定波长附近吸收曲线应较平坦,最大吸收波长,l,max,第三节 紫外-可见分光光度计,为光度测定提供,足够强度,的、,稳定,的入射光,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,吸收池,光源,检测器,单色器,信号显示系统,将光源发出的复合光分解为单色光,盛放试样并位测量提供合适的光程,将光学信号转换为电学信号的设备,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,为光度测定提供,足够强度的、稳定的,入射光,连续光源,线光源,a.,紫外光源,氢灯或,氘灯,160-375nm,b.,可见光源,卤钨灯,或钨丝灯,320-2500nm,1.光源,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,将光源发出的复合光,分解为单色光,棱镜、,光栅,a.,棱镜,入射狭缝,准直透镜,棱镜,聚焦透镜,出射狭缝,非匀排光谱,棱镜单色器,玻璃和石英,色散,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,将光源发出的复合光,分解为单色光,棱镜、,光栅,a.,棱镜,b.,光栅,闪耀光栅,d,入射狭缝,出射狭缝,反射光栅,凹面镜,光栅单色器,匀排光谱,光栅公式,衍射,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,单色器的性能指标,色散率,角色散率,线色散率,分辨率,将两条邻近谱线分开的能力,光谱带宽,有效带宽,D,：倒线色散率（n,m,m,m,-1,）,W,：,狭缝宽度（,m,m）,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,盛放试样并位测量提供合适的光程,3.吸收池,可见区,玻璃比色皿,紫外区,石英比色皿,响应光谱范围：300-800nm,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,3.吸收池,紫外区：,石英比色皿,，可见区：,玻璃比色皿,将光学信号转换为电学信号的设备,a.,硒光电池,疲劳,4.检测器,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,3.吸收池,紫外区：,石英比色皿,，可见区：,玻璃比色皿,将光学信号转换为电学信号的设备,4.检测器,a.,硒光电池,b.,光电管,响应光谱范围及灵敏度,与光敏材料有关,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,3.吸收池,紫外区：,石英比色皿,，可见区：,玻璃比色皿,将光学信号转换为电学信号的设备,4.检测器,a.,硒光电池,b.,光电管,灵敏度高 响应时间短,c.,光电倍增管,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,3.吸收池,紫外区：,石英比色皿,，可见区玻璃比色皿,将光学信号转换为电学信号的设备,4.检测器,a.,硒光电池,b.,光电管,c.,光电倍增管,d.,硅二极管阵列,l,A,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.光源,紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯,2.单色器,棱镜、,光栅,3.吸收池,紫外区：,石英比色皿,，可见区：,玻璃比色皿,将光学信号转换为电学信号的设备,4.检测器,a.,硒光电池,b.,光电管,c.,光电倍增管,d.,硅二极管阵列,l,A,e.,电荷转移器件,多道检测器,电荷偶合器件CCD,第三节 紫外-可见分光光度计一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.单光束分光光度计,三、,紫外可见分光光度计的类型,最简单的一类光度计,结构简单、操作方便、易于维修,稳定性差,吸收池,光源,检测器,单色器,信号显示系统,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.单光束分光光度计,三、,紫外可见分光光度计的类型,结构简单、操作方便、易于维修,稳定性差,2.双光束分光光度计,自动消除光源和检测器不稳定引起的误差,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.单光束分光光度计,三、,紫外可见分光光度计的类型,结构简单、操作方便、易于维修,稳定性差,2.双光束分光光度计,消除光源和检测器不稳定引起的误差,3.双波长分光光度计,消除背景干扰,切光器,第三节 紫外-可见分光光度计,一、,紫外可见分光光度计的组成,光源、单色器、吸收池、检测器,二、,紫外可见分光光度计的主要部件,1.单光束分光光度计,三、,紫外可见分光光度计的类型,结构简单、操作方便、易于维修,稳定性差,2.双光束分光光度计,消除光源和检测器不稳定引起的误差,3.双波长分光光度计,消除背景干扰，结构复杂、价格高,分离分析仪器的检测器,多通道检测器,4.多道分光光度计,第四节 分析条件的选择,一、,仪器测量条件的选择,l,A,最大吸收波长,l,max,灵敏度高,测量误差小,1.入射光波长,0.151.00,A=0.434时，吸光度读数误差最小,对于特定光度计，,D,T,/,T,为常数,2.吸光度读数范围,二、,显色反应条件的选择,显色反应,产物组成恒定、稳定；,e大、选择性好；对照性好,1.,显色即用量,2.,溶液酸度,3.,显色时间,4.,显色温度,第四节 分析条件的选择,一、,仪器测量条件的选择,最大吸收波长,l,max,灵敏度高,测量误差小,1.入射光波长,A=0.434时，吸光度读数误差最小,2.吸光度读数范围,二、,显色反应条件的选择,三、参,比溶液,消除溶液中其它组分、吸收池和溶剂对光的反射和吸收,保证吸光度真正反映样品中待测物含量,1.,溶剂参比,2.,试剂参比,3.,试样参比,4.,平行操作溶液参比,四、,干扰及消除方法,1.控制酸度,2.掩蔽,3.解蔽,4.选择适当测量波长,5.分离,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,在相同条件下测定样品和标样的紫外可见吸收光谱，,比较,吸收线轮廓,及,最大吸收波长,处的摩尔吸收系数,max,二、,结构分析,1.判断顺反异构体,2.判断互变异构体,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,紫外-可见分光光度法的最主要应用,定量依据：朗白-比耳定律,a.,标准对比法,单点校正法,c,s,c,x,c,s,和c,x,应很接近,1.单组份定量分析,如何准确确定,k,？,例：已知用1cm比色皿，在 260nm处测得1.00,10,-3,mol,L,-1,强心药托巴丁胺（M=270）的吸光度A为0.700,。取一片该药溶于水并稀释至1L，静止后取上层清液用1.00cm吸收池，于260nm波长处测得吸光度为0.350，计算该药片中含托巴丁胺多少克？,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用,定量依据：朗白-比耳定律,1.单组份定量分析,如何准确确定,k,？,b.,标准曲线法,工作曲线法,c,1,c,2,c,3,c,4,c,5,c,x,a.,标准对比法,单点校正法,A,1,A,2,A,3,A,4,A,5,A,X,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,紫外-可见分光光度法的最主要应用,定量依据：朗白-比耳定律,1.单组份定量分析,如何准确确定,k,？,b.,标准曲线法,工作曲线法,a.,标准对比法,单点校正法,试液编号,1,#,2,#,3,#,4,#,5,#,6,#,未知,Fe标准溶液/mL,0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,5.0,盐酸羟胺/mL,1,1,1,1,1,1,1,NaAc/mL,5,5,5,5,5,5,5,邻菲罗啉/mL,3,3,3,3,3,3,3,总体积/mL,50,50,50,50,50,50,50,A,0,0.120,0.238,0.362,0.484,0.597,0.382,C(Fe)=10,m,g/mL,问题3.2 紫外-可见分光光度法如何进行定量分析？,例：称取0.432g铁铵矾NH,4,Fe(SO,4,),2,12H,2,O溶于水，再定容到500.0mL。取不同量标准溶液于50.0mL容量瓶中，加显色剂定容后，测定其吸光度，结果见下表。,测定某试液铁含量时，吸取试液5.00mL，稀释至250mL，再取此稀释液2.00mL置于50mL容量瓶中，在上述相同条件下显色定容，测得吸光度为0.450，计算试液中铁含量(以g,L,-1,表示),V(Fe)/mL,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00,A,0.097,0.200,0.304,0.408,0.510,0.618,解：,根据列表数据做标准曲线,由样品溶液A=0.450，从标准曲线上查得：,V=4.40mL,稀释后的样品溶液中铁含量为：,(g,L,-1,),试液中铁含量为：,(g,L,-1,),定量依据：吸光度加和性,等吸收点法,系数倍率法,标准对比法，标准,(工作),曲线法,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,紫外-可见分光光度法的最主要应用,1.单组份定量分析,2.多组份定量分析,标准对比法，标准,(工作),曲线法,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,紫外-可见分光光度法的最主要应用,1.单组份定量分析,2.多组份定量分析,例：用分光光度法测定含有两种配合物x与y的溶液的吸光度,，获得下表数据(,l,=1.0cm)，计算未知溶液中x与y的浓度。,溶液,浓度,c/(mol,L,-1,),A,1,(,l,1,285nm),A,2,(,l,2,=365nm),x,5.0,10,-4,0.053,0.430,y,1.0,10,-3,0.950,0.050,x+y,0.640,0.370,在多个波长下测,A,，建立方程组，求解,常用于高含量组分的测定,c,s,c,x,以标准溶液为参比，测定样品吸光度,A,可有效减小浓度测定的相对误差,A,s,A,x,标准对比法，标准,(工作),曲线法,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,紫外-可见分光光度法的最主要应用,1.单组份定量分析,2.多组份定量分析,在多个波长下测,A,，建立方程组，求解,3示差分光光度法,常用于高含量组分的测定,标准对比法，标准,(工作),曲线法,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,紫外-可见分光光度法的最主要应用,1.单组份定量分析,2.多组份定量分析,在多个波长下测,A,，建立方程组，求解,3.示差分光光度法,提高分辨率,；,消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收,4.导数分光光度法,标准对比法，标准,(工作),曲线法,第五节 紫外-可见分光光度法的应用,一、,定性分析,仅作为辅助手段使用,二、,结构分析,三、,定量分析,解联立方程,四、配合物组成及其稳定常数的测定,紫色、红色、黄色三种配合物1.摩尔比法,2.等摩尔连续变化法,五、酸碱离解常数的测定,第六节 紫外-可见吸收光谱的产生,一、紫外-可见吸收光谱的产生,实现能量交换,波长/nm,300mm,分区名称,近红外光,中红外光,远红外光,微波,无线电波,1.电磁波的能量,第六节 紫外-可见吸收光谱的产生,一、紫外-可见吸收光谱的产生,实现能量交换,1.电磁波的能量,2.分子的能量,量子化,n,0,n,1,V,1,V,2,V,3,E,J,1,J,2,3.分子的能级跃迁,UV-Vis,IR,化合物分子吸收,特定波长,的,电磁波,引起,分子能级跃迁,4.分子吸收光谱的产生,5.紫外吸收光谱的产生,宽带光谱,第六节 紫外-可见吸收光谱的产生,一、紫外-可见吸收光谱的产生,吸收紫外-可见光，电子能级跃迁,二、有机化合物的紫外-可见吸收,1.有机化合物中的电子轨道及其跃迁,s键,s、s,*,轨道,p键,p、p,*,轨道,孤对电子,n,轨道,E,n,*,*,*,跃迁,n*,跃迁,*,跃迁,n,*,跃迁,2.有紫外-可见吸收的有机化合物,含p键的有机物,含非键电子的不饱和有机物,共轭体系,杂原子,第六节 紫外-可见吸收光谱的产生,一、紫外-可见吸收光谱的产生,吸收紫外-可见光，电子能级跃迁,二、有机化合物的紫外-可见吸收,三、无机化合物的紫外-可见吸收,共轭体系，含杂原子,Fe,3+,-SCN,Fe,2+,-SCN,电子接受体,电子给予体,配位化合物中心离子d或f分裂引起的吸收光谱,1.电荷转移光谱,2.配位体场吸收光谱,第六节 紫外-可见吸收光谱的产生,一、紫外-可见吸收光谱的产生,吸收紫外-可见光，电子能级跃迁,二、有机化合物的紫外-可见吸收,三、无机化合物的紫外-可见吸收,共轭体系，含杂原子,四、影响化合物紫外-可见吸收光谱的因素,1.共轭效应,共轭体系增长，最大吸收波长和吸收强度增大,CH,3,-CH=CH-CH=CH-CH,3,CH,2,=CH-CH=CH-CH=CH,2,2.立体化学效应,空间位阻、构象、跨环共轭等因素引起,3.溶剂的影响,溶剂效应,溶剂吸收,4.pH的影响,pH改变导致共轭体系延长，吸收峰红移,pH改变导致共轭体系缩短，吸收峰蓝移,一、什么是紫外-可见吸收光谱？,二、紫外-可见吸收光谱是如何产生的？,三、紫外-可见吸收光谱为什么是带状光谱？,四、有机化合物分子中具有哪些跃迁类型？其中哪些跃迁的UV-Vis吸收最有应用价值？,五、有关术语(最大吸收波长、肩峰、末端吸收、生色团、助色团、红移、蓝移或紫移、增色效应与减色效应),六、影响紫外-可见吸收光谱的因素有哪些？是如何影响的？共轭、立体化学、酸度,pH,七、溶剂极性改变将对,UV-Vis,光谱产生何种影响？选择溶剂时应考虑哪些问题？,八、,UV-Vis,定量分析基础是什么？,九、导致朗伯-比尔定律偏离的主要因素有哪些？,十、,UV-Vis,分光光度计由哪些部件组成？各部件作用如何？,十一、,UV-Vis,分光光度计使用的光源有哪两种？分别用于何区间？,十二、,UV-Vis,分光光度计单色器有哪两种？单色仪有哪些部分组成？性能指标有哪些？,十三、,紫外和可见区,分光光度测定时，应分别使用那种吸收池？,十四、,UV-Vis,分光光度计检测器有哪几种？,十五、,UV-Vis,分光光度计有哪几种类型？各有何特点？,十六、,UV-Vis定量,测量时，入射光波长如何选择？为什么？吸光度读数多大为好？,十七、,UV-Vis,定量测定时，需要控制哪些显色条件？干扰如何消除？,十八、,UV-Vis,分光光度法是如何进行定性分析的？,十九、,UV-Vis,定量分析方法有哪些？如何操作与计算？各有何特点？,