1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,主题,：,观察衰老细胞中线粒体数变化,目的：,1,、掌握线粒体活体染色原理及方法,2,、了解动物细胞不通时期细胞内线粒体形,态、数目、分部特征,3,、初步掌握哺乳动物细胞传代培养的基本,操作过程，为生物技术在医学上的应用,打下基础,原理,1,、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生变化。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿,B,（,Janus green B,）是活体染色中重要的染料，对线粒体有专一性。詹纳斯绿,B,解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体
2、膜上。詹纳斯绿,B,可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基,2,、活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，
3、这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料都可作为活体染色剂使用，一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料（易溶于类脂质）并配成较稀的溶液来使用。,实验方法,1,、将小鼠拉颈椎致死，置,75%,酒精泡,2-3,秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取肝组织带入超净台内，置平皿中。,2,、用手术剪将组织剪成小块（,1mm,3,），再用,Hanks,液洗三次，视组织块量加入,5-6,倍体积的,0.25%,胰酶液，,37,中消化,20-40,分钟，每隔,5,分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。,3,、加入,3-5ml,培养液以终止胰酶消化作用。静置,5-10,
4、分钟后,1000rpm,，离心,10,分钟，弃上清液。,4,、加入,Hanks,液,5ml,，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。,加入培养液,1-2ml,（视细胞量），血球计数板计。将细胞调整到,510,5,/ml,左右，转移至,25ml,细胞培养瓶中，,37,下培养。,5,、取部分原代细胞染色制片观察线粒体数，拍照。,6,、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。加入,12ml 0.25,胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。,7,、马上吸走胰酶液 ，再次加入,2ml,左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟。,8,、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，根据比例来取需要的量，加入,4ml,左右的培养液。,9,、前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱。,10,、查阅资料了解小鼠肝细胞体外培养分裂周期，在每次分裂后取部分细胞染色制片观察，拍照。,11,、直至细胞不在分裂，观察所有照片对比线粒体数目。,12,、分析讨论得出结论。,结论,随着细胞传代数目的增加，培养细胞内线粒体数量呈逐渐减少的趋势，体积也在逐渐变大。,
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