版药典无菌检查法与微生物鉴定.ppt

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进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。,无菌技术,是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。,无菌检查法的局限性,由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识即产品通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。,从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器进行无菌检查。但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不可能对每一最小包装的产品进行检查。,统计概率的局限性：对于低污染水平的产品，其局限性在统计学上更为明显。,检验条件的局限：样品中污染的微生物的检出受多种因数的影响，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生长时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性。,污染的检出率要比实际产品的污染率低。,无菌检查存在检查失误的可能性：这可能是因为污染菌浓度太低，或是污染菌生长太慢，或是因为培养基不良等原因，在培养期间污染菌根本就不生长。产品的染菌率愈小，错判合格的可能性就愈大。,所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时，仅依靠最终产品的无菌检查是不充分的，局限性较大。对无菌制品来说，生产最终产品的所有系统的工艺才是最重要的,。,2015,版中国药典无菌检查法,2015,版中国药典无菌检查法的修订,无菌检查法的方法适用性试验,无菌检查法的注意事项,2015,版中国药典无菌检查法的修订,实验环境的修订,检查用培养基的修订,具体修订内容,实验环境的修订,2010,年版,2015,年版,无菌检查：,应在洁净度,10000,级背景下的局部,100,级单向流空气区域内或隔离系统中进行。,无菌检查：,应在洁净度,B,级背景下的局部,A,级单向流空气区域内或隔离系统中进行。,微生物限度检查：,应在洁净度,10000,级背景下的局部,100,级单向流空气区域内进行。,微生物限度检查：,应在受控洁净环境下（不低于,D,级）的局部不低于,B,级单向流空气区域内进行。,修订的依据,修订依据及意义：2010版GMP附录一,无菌药品,和附录三,生物制品,中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！,ICH,：检查方法中要求“试验应在无菌条件下进行，防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出”。,2015,版中国药典通则,9203药品微生物实验室质量管理指导原则,9205,药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则,9206,无菌检查用隔离系统验证指导原则,GMP2010,年版对洁净度的规定及确认标准,50,100,200,不作规定,不作规定,29000,3520000,D,级,25,50,100,29000,3520000,2900,352000,C,级,5,5,5,10,2900,352000,29,3520,B,级,1,1,1,500,个的规格为,1ml,的注射液，表,1,规定接种每种培养基的最少检验数量为,20,个或,2,（取较少者），表,3,规定全量接种。,直接接种法 每管培养基接种样品的量,6,验证（一次）,薄膜过滤法 每株菌,20,瓶，,6,株菌,120,瓶,直接接种法,40,瓶,+,阳性,无菌检查,薄膜过滤法,40,瓶,+20,瓶（阳性）,=60,瓶,方法适用性试验结果的判断：,与对照管比较，如含供试品的各试验管的实验菌均生长良好，可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。,如含供试品的任一试验管的实验菌生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂、更换滤器品种等方法，重新进行方法验证。,无菌检查法的注意事项,培养基的要求：,灵敏度检查符合规定。,硫乙醇酸盐流体培养基氧化层：,接种前：培养基氧化层的高度不超过培养基深度的,1/5,，否则须经,100,水浴加热至粉红色消失（不超过,20,分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止过程中污染。,培养后：装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层不超过培养基的,1/2,。,检验方法的选择,薄膜过滤法：一般采用封闭式,滤器。,只要供试品性质允许，,应采用薄膜过滤法。,直接接种法：适用于无法用,薄膜过滤法进行实验的品种。,供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。,无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。,常用中和剂比例,0.1,大豆卵磷脂,0.11,吐温,80,卵磷脂、吐温,80,及,L,组胺酸用于中和醛类及酚类化合物,卵磷脂及吐温,80,中和季铵盐,卵磷脂中和氯己定,吐温,80,中和双三氯酚及汞化合物,薄膜过滤法,水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。,油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。,为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。,供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。,直接接种法,除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。,接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置3035培养，一份置2025培养。,供试品的无菌检查,阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：,无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；,抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；,抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；,抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。,阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。,阳性对照管培养72 小时应生长良好。,供试品的无菌检查,阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,培养和观察,硫乙醇酸盐流体培养基置,30,35,，,胰酪大豆胨液体培养基置,20,25,，培养,14,天。,逐日观察记录。,阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。,无菌检查一次检出！,培养基浑浊，培养,14,天后不能判断：,转种至同种新鲜培养基中，培养三天，或取培养液涂片，染色镜检。,结果判断,阳性（,+,）阴性（,-,）,供试品管浑浊，即判不合格 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含的微生物。,设备，环境的微生物监控结果超标。,回顾实验过程，发现污染因素。,鉴定微生物，确认是操作引入的。,无菌试验经确认无效，可重试。,实验过程监控,表面监控,环境菌监控,手部监控,环境微生物归属：,约大于,50,的革兰氏阳性菌来自人员；,30,的革兰氏阳性芽孢杆菌来自产品外包装；酒精对革兰氏阳性芽孢杆菌无效；革兰氏阴性假单胞菌存在于新洁尔灭中；丁基胶塞会因负压而将消毒剂中的污染菌引入样品。,无菌程序保障,无菌检查样品前处理：,分批消毒、实验（混合）统一消毒，统一实验,严格遵守外表面消毒程序：,一般环境酚类，洁净环境过氧乙酸,+75%,乙醇（无菌级）,增加过程监控力度：,表面菌采样、手部采样（每批）、动态浮游菌采样（下风口）,微生物鉴定,微生物鉴定指导原则,(,通 则,9204),：为非无菌药品微生物限度控制菌检查中疑似 菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。,当微生物的鉴定结果有争议时，以,伯杰氏系统细菌学手册,Bergey s Manual of Systematic Bacteriology,现行版的鉴定结果 为准。,微生物鉴定,微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的 重要环节，药典通则相应章节中对检出微生物的鉴定做了明 确规定，如“非无菌产品的微生物检查：控制菌检査（通则,1106)”,中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进 行鉴定；对“无菌检查法,(,通 则,1101)”,的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；“药品洁净实 验室微生物监测和控制指导原则（通 则,9205)”,中建议对洁 净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境 微生物污染情况，有助于污染调查。,微生物分类,界（,Kingdom,）,(Regnum),门（,Phylum,）,(Phylum),纲（,Class,）,(Classis),目（,Order,）,(Ordo),科（,Family,）,(Familia),属（,Genus,）,(Genus),种（,Species,）,(Species),微生物分类,每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科,.,词尾：门：,-phyta,，纲：,-mycetes,，目：,-ales,，科：,-aceae,，亚目：,-ineae,，亚科：,-oideae,。,种：是最基本的分类单位，,一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株的总称。,客观存在，相对稳定。,来自共同祖先，有着相近的亲缘关系。,形态、生理特征上表现十分相似。,存在差异和变异。,变异发展到一定程度，即形成新种或变种。,变种：种内某一个体可能由于突变而发生变异，在自然选择和人工选择下，这种变异会在种内不断扩散，最后形成某些遗传性不同于原种的一个群体。,亚种：指某一明显而稳定的特征与模式种不同的种，有时称小种。在微生物学中，通常把实验室所获得的变异菌株称之为亚种。,型：同种微生物彼此之间的区别不如变种显著，一般表现在菌体的化学组分上。如：结核杆菌人型、牛型和禽型。,菌株（,strain,）：又称品系，指一种微生物的不同来源的纯培养物，在微生物学的研究中运用最为广泛。从自然界中分离到的每一个纯培养物都可以称为一个菌株或品系。,自然界“种”,有限，菌株,无限。,微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环 境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态 学、细胞形态学（杆状、球状、细胞群孢子形成模式等）、革兰染色或其他染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生 化反应（如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应,),进行分析，一 般即可满足需要；非无菌产品的控制菌检査一般应达到种 属的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培 养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平。,菌株保藏中心,美国典型微生物菌种保藏中心（,ATCC,）,美国农业研究菌种保藏中心（,NRRL,）,德国微生物菌种保藏中心（,DSMZ,）,荷兰微生物菌种保藏中心（,CBS,）,英国微生物菌种保藏中心（,NCTC,）,中国工业微生物菌种保藏管理中心（,CICC,）,医学微生物菌种保藏管理中心（,CMCC,）,微生物鉴定条件,待鉴定的微生物必须是纯种微生物，在鉴定前，需将菌株纯化，获得纯培养物。,选取权威鉴定手册。,选择适当鉴定方法，确定主要测试项目。,微生物鉴定程序,待检菌的分离纯化,初筛试验,表型微生物鉴定,基因型微生物鉴定,经典鉴定方法,形态特征：大小，排列，分化，结构，染色等,培养特征：营养要求，生长的物理环境（酸碱 度，温湿度），菌落，菌苔，液体 培养特征。,代谢特征：微生物生命活动的方式。如：,I.M.Vit,化学组成特征：细胞主要特征性化学成分的鉴定 如：细胞壁成分、细胞内含物,抗原特征：抗原成为化学组成的一个特殊方面，微生物具有许多不同类型的抗原。,生态特征与其他生物的关系、自然界的分布、致病性等,待检菌的分离纯化,最常用,的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划,线分离纯化，以获取待检菌的纯培养物（单个菌落）,。,各类微生物的菌落特征,微生物类别,菌落特征,单细胞微生物,菌丝状微生物,细菌,酵母菌,放线菌,霉菌,主要特征,细胞,形态特征,小而均匀、,个别有芽孢,大而分化,细而均匀,粗而分化,相互关系,单个分散或按一定方式排列,单个分散或,假丝状,丝状交织,丝状交织,菌落,含水情况,很湿或较湿,较湿,干燥或较干燥,干燥,外观特征,小而突起,或大而平坦,大而突起,小而紧密,大而疏松,或大而致密,参考特征,菌落透明度,透明或稍透明,稍透明,不透明,不透明,菌落与培养基结合度,不结合,不结合,牢固结合,较牢固结合,菌落的颜色,多样,单调,十分多样,十分多样,菌落正反面颜色差别,相同,相同,一般不同,一般不同,细胞生长速度,一般很快,较快,慢,一般较快,气味,一般有臭味,多带酒香,常有泥腥味,霉味,初筛试验,常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌做初步分类。,常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。,区分葡萄球菌,(,过氧化氢酶阳性）和链球菌,(,过氧化氢酶阴性）,过氧化氢酶及过氧化物酶实验：,2H,2,O,2,过氧化氢酶,2H,2,O+O,2,过氧化物酶：,RH,2,+H,2,O,2,过氧化物酶,R+2H,2,O,阳性：细菌变为黑褐色，有气泡产生；,阴性：不变色。,阳性,阴性,区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）,和肠道菌（氧化酶阴性）,细胞色素氧化酶实验：,细胞色素,C,细胞色素氧化酶,氧化型细胞色素,C+,对苯二胺,+,-,奈酚 靛酚兰（蓝色）,阳性：,2,分钟内生成蓝色为阳性；,阴性：无变化。,阳性,阴性,凝固酶实验：,区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌,(,很可能为致病,玻片法,性）。,试管法,柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）,：,一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。,阴性,阳性,甲基红实验（,MR,实验）：,一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的,pH,值下降到,4.5,以下，加入甲基红指示剂出现红色反应。,阴性,阳性,V-P,实验：,一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。,阴性,阳性,表型微生物鉴定,表型微生物鉴定,在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响。目前已有的基于碳源利用和生化反应特征的鉴定方法，如气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征、,MALD1-TOF,质谱法分析微生物蛋白等微生物鉴定系统，在进行结果判断时需借助于系统自身的鉴别数据库，还依赖特定的培养基和培养方法以确保鉴定结果的一致性。,生长在固体,培养基上的菌落,全细胞,MALDI-TOF,谱图,数据库中参考谱图,输出可信鉴定结果,找到匹配度最可信的谱图,各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！,基因型微生物鉴定,与表型特征不同，微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析。,由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，所以,DNA-DNA,杂交、聚合酶链反应、,16S rRNA,序 列 和,18S rRNA,序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、,DNA,探针和核糖体分型分析等基因型微生物鉴定方法理论上更值得信赖。,基因型的鉴定可通过,DNA,杂交、限制性酶切片段图谱 的比较和,/,或,D NA,探针完成，若,DNA-DNA,的杂交亲缘关系大于,70%,时，表明微生物是同一种属。,基因型微生物鉴定,rRNAs,记录了微生物的进化历史，对这些序列进行分析可以对微生物进行系统分类和鉴定。,16S rRNA,被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”，可以作为测量各类生物进化的工具。,rRNA,在细胞中含量大,(,约占细胞中,RNA,的,80%),也易于提取。,rRNA,具有重要且恒定的生理功能。,16SrRNA,普遍存在于真核生物和原核生物中,(,真核生物中其同源分子是,18SrRNA),。,16SrRNA,分子量大小适中，便于序列分析。,在,16SrRNA,分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究,。,APl Listeria,20E,API 1OS,API,VITEK,APl Listeria,20E,API 1OS,BD PHOENIX,全自动微生物鉴定系统,GenomeLab GeXP,遗传分析系统,溯源分析,溯源分析是通过对污染微生物和相关环节监控微生物进行比对，以同源性的差异程度为依据，确认污染来源的过程。,菌株水平的鉴定在污染调查过程中非常重要，尤其适用于产品中的微生物数量高于建议水平或出现异常高的微生物 检出情况时。菌株水平的鉴定在无菌工艺中也很重要，在无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工艺失败时，应对检出的微生物进行评估。,溯源分析,实际工作中无菌试验阳性结果中分离出的微生物，经对 其溯源分析，确认污染归因于无菌试验过程中所使用的材料 或无菌技术的差错，该试验可判无效，否则判该产品不符合要求。对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行适当比率的鉴定，掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。,伯杰氏系统细 菌学手册,(Bergey s Manual of Systematic Bacteriology),美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰,(D.Bergey)(1860-1937),伯杰氏系统细菌学手册,1923,年第一版,1948,年第六版,1925,年第二版,1957,年第七版,1930,年第三版,1974,年第八版,1934,年第四版,1994,年第九版,1939,年第五版,谢谢！,