分子生物学第五章1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,转录,（transcription）,是以,DNA为模板,，在依赖DNA的,RNA聚合酶,的催化下，以4种,rNTP,（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。,转录是DNA将遗传信息传递给蛋白质的中心环节,。,在有些RNA病毒中，,RNA也可以指导RNA的合成。,基因转录：DNA mRNA,The function of polymerase is to copy one strand of duplex DNA into RNA,1957年 Crick提出了中心法测(central,dogma),DNA RNA 蛋白质,1970 Crick又作了部分修改：,DNA RNA 蛋白质,转录起始于RNA聚合酶和,启动子(promoter),结合之后，转录起始的第一个碱基称为,转录起始点(start point),。在RNA聚合酶的作用下合成RNA，至,终止子(terminator),终止。,由启动子到终止子之间的序列称为,转录单位(transcription unit),。转录起始点前面的序列称为,上游,(upstream)，后面的序列称为,下游,(downstream)。,A transcription unit is a sequence of DNA transcribed into a single RNA，starting at the promoter and ending at the terminator,RNA,合成和,DNA,复制的区别,（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制 时两条链都可作为模板；,（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链成双链；,（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物；,（4)转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；,（5）聚合酶系不同。,第一节 转录酶和转录因子,1960年Weiss,等发现RNA聚合酶（RNA Pol）。,其特点是：,（1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物；,（2）以DNA为模板；,（3）按5-3方向合成；,（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；,（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；,（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；,（7）RNA的序列和模板是互补的。,RNA pol和DNA pol有2点不同：,（1）RNA pol没有任何校对功能；,（2）能起始新的RNA链。,一、原核生物的RNA聚合酶,大部分原核生物的RNA聚合酶的结构十分相似，在聚合酶的表面形成一条约2.5nm的,通道,，是,容纳DNA分子,的场所。,细菌RNA聚合酶的大小约为9.5 nm,9.5 nm 16 nm。,1.大肠杆菌RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶由多亚基组成，,全酶组装过程为,2,+,，分子量为480 KDa左右,。,亚基与全酶结合疏松，很容易与全酶分离。,全酶可以起始RNA的合成，之后亚基从全酶解离下来。,Bacterial RNA polymerase have four types of subunit;,and have rather constant,sizes in different bacterial species,but varies more widely.,亚基可能参与,全酶的组装及全酶识别启动子,。另外，亚基还参与RNA聚合酶与一些,转录调控因子,间的作用。,亚基具有,与底物（NTP及新生的RNA链）结合的能力,。利福霉素可以阻断转录的起始，链霉溶菌素可抑制延伸反应，二者均是通过与亚基的结合而发挥作用的。,亚基可能,与模板结合,。,肝素可与亚基结合而抑制转录，并且可以和亚基竞争DNA的结合位点。,亚基和亚基提供了RNA聚合酶的活性中心,，其一级结构与真核生物RNA聚合酶大亚基有同源性。,亚基的功能是,帮助全酶识别启动子并与之结合,。亚基也可被看作一种,辅助因子,，因此又可称为,因子,（Sigma factor）,。,在转录过程中，RNA聚合酶需要与其他,蛋白质辅助因子,（转录因子）共同作用，才能保证转录的顺利进行。如转录终止时的终止因子和抗终止因子。,大肠杆菌RNA聚合酶,多亚基的复杂结构,主要是为酶提供了与多种因子相互作用的能力，从而可以识别多种启动子。,2.,因子,RNA聚合酶要负责所有基因的转录，也就是说要识别所有转录单位的启动子。因此，,因子在RNA聚合酶识别启动子的过程中起关键作用,。,因子的二级结构属于螺旋，是通过,识别启动子上的某一序列来控制RNA聚合酶与启动子的结合,的。,A map of the,E.coli,70,factor identifies conserved regions.Regions 2.1 and 2.2,contact core polymerase,2.3 is required for,melting,and 2.4 and 42,contact the -10 and-35 promotor elements,.The N-terminal region prevents 2.4 and 4.2 from,binding to DNA,in the absence of core enzyme.,E.coli,sigma factors recognize promoters with different consensus sequences.(Numbers in the name of a factor indicate its mass),Amino acids in the 2.4,-,helix of ,70,contact specific bases in the non-template strand of the-10 promoter sequence.,目前已发现了至少4种因子。,在细菌受到外界环境的急剧影响时，会改变所表达的基因，产生,因子更替的现象,。如环境温度升高时，大肠杆菌会开启,rpoH,基因的表达，其产物,32,能识别热激基因的启动子，而正常状态下表达的基因会关闭或表达水平下降。,芽孢菌生活周期过程中生活方式的改变也是通过,因子的更替完成的。,RNA pol,执行多种功能,(1)识别DNA双链上的启动子；,(2)使DNA变性，在启动子处解旋成单链；及再旋酶活性。,(3)通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链。,(4)聚合NTP活性。,(5)最后当它达到终止子时，通过识别终止子停止转录。,二、真核生物的RNA聚合酶,在真核生物细胞中，共有三类RNA聚合酶，即RNA聚合酶、RNA聚合酶 和RNA聚合酶。,它们对,鹅膏蕈碱,（,-amanitine,）的敏感性不同，在细胞核中的定位也有差异。,Yeast RNA polymerase has grooves that could be binding sites for nucleic acids.The pink beads show a possible path for DNA that is 25 wide and 5-10 deep.The green beads show a narrower channel,12-15 wide and 20 deep,that could hold RNA.,NTP uptake channel is in the back,channels into and out of the open complex,DNA entering channel,B220240Kda与模板结合，与链的起始，延伸有关，相,当于原核 RNA Pol的亚基C端含有羧基末端功能区,大亚基 B140150Kda与DNA、底物和新生的RNA结合，相当于原核RNA Pol,B44.5酶的连接，相当于原核RNA的亚基,RNA Pol ABC 27KDa 磷酸化蛋白，,1类三种RNA Pol共有，如 ABC 25.5KDa 与DNA结合有关,ABC 23KDa,B 12.6,小亚基 2类Pol 特有 B 23,B 14.5,B 10,3类在某些条件下可除去的亚基 B 23参与酶的基本结构,B 16.5,细胞器的RNA Pol和噬菌体的RNA相似，因有单一固定的功能，分子量较小,表12-3 真核生物聚合酶的成分及功能,RNA聚合酶,位于核仁，活性所占比例最大，,负责rRNA（5.8S、18S和28S）的转录,。RNA聚合酶负责了大部分细胞RNA的转录。,RNA聚合酶,位于核质，活性所占比例仅次于RNA聚合酶，主要负责核内不均一RNA(heterogenous nuclear RNA,hnRNA/mRNA前体）的转录。,RNA聚合酶,也位于核质，活性所占比例最小，,负责tRNA、5SRNA、,Alu,序列和其他小RNA的转录,。,真核生物的RNA聚合酶的分子量都很大，由8至14个亚基组成。经,纯化的RNA聚合酶,具有以DNA为模板合成RNA的能力，但,不能正确地选择启动子,。,目前尚不能完成RNA聚合酶的体外重建，无法确定哪些亚基是活性所必需的。,第二节 启动子,启动子(promoter),是指DNA分子上,被RNA聚合酶识别并结合,，形成,起始转录复合物,的区域。启动子上还包括一些,调节蛋白因子,的结合位点。,启动子是控制转录起始的序列,，并决定着某一基因的,表达强度,。与RNA聚合酶亲和力高的启动子，其起始频率和效率均高。,一、原核生物的启动子,在原核生物的基因组中，能够被RNA聚合酶识别的最小DNA片段为,12 bp,。,研究启动子特性的方法之一是比较不同启动子的序列，从中发现一些,同源性,比较强的部分，又称为,保守序列,。,原核生物,启动子（promoter）的结构和特点,(1)典型结构,都含,识别,（,R,),结合,（,B,)和,起始,（,I,）位点;,(2)序列保守;,(3)位置和距离都比较恒定；,(4)直接和多聚酶相结合；,(5)常和操纵子相邻；,(6)位于基因的5端；,(7)决定转录的启动和方向。,(8)特殊的启动子的,R,B,序列不同。,1.原核生物启动子的结构,典型的原核生物的启动子的结构为：,35区、1619 bp的间隔区、10区和转录起始点，10区到转录起始点的距离为7 bp,转录起始点,转录起始点在多数情况下为嘌呤,，常见的序列为CAT，A为转录起始点。,转录起始点左右的碱基也可影响转录的起始。例如，1至30的转录区可以影响RNA聚合酶对启动子的清除，从而影响启动子的强度。,10区,在,转录起始点的上游,有一个,6 bp的保守序列,，由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为,Pribnow,框盒（Pribnow box）。几乎在目前已知的所有启动子中均存在。,保守序列的中心位于转录起始点上游约10 bp处，这一保守序列又称为10序列。,其一致序列为TATAAT,，又称,Pribnow框,、,结合位点,，在RNA聚合酶的作用下首先解链。,其功能是,：,(1)RNA pol紧密结合;,(2)形成开放启动复合体；,(3)使RNA pol定向转录。,35区,又称为,Sextama,框盒（Sextama box）,。,在转录起始点上游35 bp处，有另一个保守序列，称为35序列。其保守序列为TTGACA，,RNA聚合酶的,因子可以识别该位点,，称为,识别位点,，RNA聚合酶首先与识别位点结合，然后与结合位点相互作用。,该区域是启动子强弱的决定因素,。,其功能是,:,(1)为RNA pol的识别位点。,亚基识别,-35,序列，为转录选择模板,(2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNA pol的结构有关。,10区与35区间的距离,35区和10区之间的距离在绝大多数原核生物启动子为16到18 bp。该区域的碱基序列并不重要，但,该距离的长短是至关重要的,。,适宜的距离可以,为RNA聚合酶提供合适的空间结构,，便于转录的起始。,2.启动子功能的研究方法,研究启动子功能的主要方法是,启动子的突变,。启动子碱基序列发生变化，可以改变启动子的强弱。,目前所知，几乎影响启动子功能的所有点突变均发生在,两个保守区域,内，即,10区和35区,。35区的功能是提供RNA聚合酶的识别信号，而10区是使封闭复合物转变为开放复合物。,3.RNA聚合酶与启动子的结合,研究RNA聚合酶与DNA之间的识别以及结合常常采用,足迹法（footprinting）,。,经测定，RNA聚合酶与启动子结合的区域为,50至20,，这段序列包括了,结合及起始所需的序列,。,另一种研究启动子的方法是采用,碱基修饰,的方法。,可先用,碱基修饰试剂,对DNA和RNA聚合酶的复合物进行修饰，未与RNA聚合酶结合的DNA，其相应的碱基被修饰。而结合了RNA聚合酶的碱基则不被修饰。,这些分析方法可以,确定与RNA聚合酶紧密结合的位点,。,有趣的是，在10区上游的所有紧密结合位点均位于一条DNA链上。这可使,RNA聚合酶从DNA的一个侧面接近并识别启动子并与之结合,。,One face of the promoter contains the contact points for RNA,二、真核生物的启动子,1.RNA聚合酶启动子的结构,RNA聚合酶的启动子主要由两部分组成的(bipartite)：,核心启动子（core promoter）,位于45至20的区域内，足以使转录起始。,上游调控元件（upstream control element）,位于180至107，可提高转录起始效率2.RNA聚合酶,启动子的结构,RNA聚合酶主要负责,编码蛋白质和部分核内小rRNA,（small nuclear RNA，snRNA）的基因的转录，其启动子结构最为复杂。,RNA聚合酶单独并不能起始转录，必须和其他的,辅助因子,共同作用形成,转录起始复合物,才能起始转录。,RNA聚合酶的启动子位于转录起始点的上游，由,多个短的序列元件,组成，主要有三个保守序列：,（1）,帽子位点,，又称转录起始位点，其碱基大多数为A，这与原核生物相似。,（,2）,TATA框,，位于30处，又称,Hogness框,。一致序列TATAA（T）AA（T）。有些TATA框的突变不影响转录的起始，但可以改变转录起始位点。说明,TATA框具有定位转录起始点,的功能。,（3）,CAAT框,，位于75处，一致序列为GGC（T）CATCT。CAAT框内的突变对转录起始的影响很大，决定了启动子,起始转录的效率及频率,。,另外还有GC框（GC box）、八聚核苷酸元件（octamer element）等元件。,类基因的启动子和调控区,TATA框,核心元件,起始子（initiator，Inr）:一般由P,Y2,CAP,Y5,构成，,位于-3+5，可能提供RNA pol 识别信号。,CAAT box、,类启动子 上游元件组成 GC box,Oct,增强子（enhancer）,远端调控区 减弱子（dehancer）,静息子（silencer）,上游激活序列（upstream activating,sequences UASs,）,在不同的启动子中，这些元件的组合情况是不同的。,各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，而这些蛋白因子共同组合成,起始复合物,。,人类型启动子的基础转录因子,因子 分子量 功能,RNAPol 10K 依赖模板合成RNA,TFA12,19,35K 稳定TFD和DNA的结合，激活TBP亚基,TFB33K 结合模板链（-10+10），起始Pol结合，和TFE/F,相互作用,TFD(TBP,30K)TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别,特殊启动子,TFE34K()结合在Pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游,57K(),TFF38,74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和Pol结合，,介导其加入复合体,TFH 具激酶活性，可以磷酸化PolC端的CTD，使Pol逸出，延伸,TFI120K 识别Inr，起始TFF/D结合,TFJ 在TFF后加入复合体，不改变DNA的结合方式,TFS RNA合成延伸,3.RNA聚合酶,启动子的结构,RNA聚合酶转录5S rRNA、tRNA和部分snRNA。这三种启动子的结构是不同的，RNA聚合酶也必须和其他的辅助因子共同作用，才能识别不同的启动子。,5S rRNA和tRNA基因的启动子位于转录起始点的下游,，称为,内部启动子,（internal promoter）。,snRNA基因,的启动子位于转录起始点的,上游,，和其他基因的启动子比较相似。,、,研究真核生物启动子的方法,研究真核生物启动子结构与功能的方法主要有：缺失、点突变和足迹法。,研究启动子的位置及长度用缺失和点突变进行。,研究蛋白质辅助因子与启动子的相互作用可采用,DNase、,足迹法及凝胶阻滞法。,第三节 终止子,在转录的过程中，提供转录终止信号的序列称为,终止子（terminator）,。,无论是原核生物还是真核生物都可以,通过控制转录的终止来对转录进行调控,。这也是,基因表达调控的重要手段,。,一、原核生物的终止子,大肠杆菌和噬菌体中进行的体内和体外实验表明，,真正起终止作用的不是DNA序列本身，而是转录生成的RNA,。在这一点上，终止子和启动子不同。新生的RNA中可有多处发夹结构。,比较不同原核生物的终止子序列，发现其同源性很差。,大肠杆菌有两种类型的终止子,：,1 内在终止子,（intrinsic terminator）,又称为,不依赖,因子的终止子,。只有核心酶和终止子就足以使转录终止，不依赖其他其他辅助因子的作用。,不依赖,因子的终止子在结构上有两个特征，一个是转录生成的RNA形成,发夹结构,，二是发夹结构末端紧跟着,6个连续的U串,。,Intrinsic terminators include palindromic regions that from hairpins varying in length from 7 to 20 bp.The stem-loop structure includes a,G-C-rich region,and is followed by a run of,U residues.,发夹结构中的突变可阻止转录的终止，说明了,发夹结构在转录终止中的重要作用,。,研究发现，发夹结构只是使,转录过程暂停,，为转录的终止提供了机会。如果没有终止子序列，聚合酶可以继续转录，而不发生转录的终止。,6个连续的U串可能为RNA聚合酶与模板的解离提供了信号,。,2 依赖,因子的终止子,依赖因子的终止子必须在,因子,的存在下才能终止核心酶的转录作用。,依赖,因子的终止子序列，,特别是实际终止位点之前的序列富含C，而G含量相对较少,。大肠杆菌中依赖,因子的终止子相对较少。,the,r,transcription terminator,Hexamer,Open ring,RNA tread trough the“ring”,二、真核生物的终止子,与原核生物相比，对真核生物的终止子了解较少。,不同的RNA聚合酶有不同的终止子。RNA聚合酶和有类似于原核生物的终止元件。RNA聚合酶是否有类似的终止元件还不是很清楚。,增强子,它是在1981年由Benerji,Rusconi小组和Chambom等发现的，又称,远上游序列,（far upstream sequence）。,其特点是：,具有远距离效应。,无方向性。,顺式调节。,无物种和基因的特异性。,具有组织的特异性。,有相位性。其作用和DNA的构象有关。,有的增强子可以对外部信号产生反应。,增强子为什么具有远距离作用呢？,（1）拓朴效应；拓朴效应说认为增强子的 作用是诱导染色质结构变化，使核小体产生DNaseI敏感区。,（2）滑动模型；,（3）成环模型。,Enhancer,Promotor,