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杂交瘤技术制备单克隆抗体.ppt

1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单克隆抗体(,McAb,):,是由只识别单一抗原决定簇的,B,细胞克隆产生的同源抗体。,理化性状高度均一,效价高,只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一,具有高度特异性又易于大量制备,如何获得,McAb?,如何大量获得,McAb?,需要克服哪些技术问题?,理想的抗体分泌细胞:,具有合成和分泌抗体的能力,具有大量无限生长的特性,在,1975,年,,Kohler,和,Milstein,将来

2、源于小鼠骨髓的,骨髓瘤细胞,和啮齿动物可以,分泌抗体的细胞,融合后形成杂交瘤细胞,该杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力,也具有免疫细胞分泌抗体的能力,后来将这种杂交细胞系统统称为,杂交瘤,(,hybridoma,)。,通过筛选,分离得到针对,特异性抗原,并具有所要求的抗体亲和力的,杂交瘤细胞,。在适当营养条件下,杂交瘤细胞能够,生长和无限制性传代,,并且能产生,大量单一类型的抗体,及单克隆抗体。,一、杂交瘤技术的基本原理,二、单克隆抗体的制备,三、单克隆抗体的应用,一 杂交瘤技术的基本原理,利用,聚乙二醇,作为细胞融合剂,使免疫的,小鼠脾细,胞,与具有在体外不断繁殖能力的,小鼠骨髓瘤细胞,融

3、为一,体,在,HAT,选择性培养基,的作用下,只让融合成功的杂交瘤细胞生长,经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养(克隆化),最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的,杂交瘤,细胞系,,将这种细胞扩大培养,接种于小鼠腹腔,在其产生的腹水中即可得到高效价的,单克隆抗体,。,流,程,杂交瘤技术,1.,颗粒性抗原,免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果,2.,可溶性抗原,免疫原性弱,一般要加佐剂,,可溶性抗原10-,50ug/100ul+,等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔,,2-4周后加强免疫(量减半,改用不完全佐剂,可反复多次),冲击免疫(融合前3天进行),选用6-12周龄,Balb/c,小

4、鼠,免疫方案,不产生,Ig,的重链和轻链,HGPRT-,与提供淋巴细胞的动物品系相同,小鼠骨髓瘤细胞,处于免疫状态脾脏中的,B,淋巴母细胞或浆母细胞,动 物:,6,12,周龄,20g,25g,体重,免疫脾细胞,细胞融合剂:,PEG:,分子量,4000,的,PEG,是最常用的细胞融合剂,作用机理:,诱导细胞膜上脂类物质结构重排,使细胞膜易打开而有助于细胞融合,作用特点:,不同的分子质量、浓度、作用时间、,pH,可能直接影响融合效果,细胞融合,培养骨髓瘤细胞:,对数生长期,浑圆、透亮、均一、排列整齐,避免细胞返祖:定期用,8-AG,处理细胞,1-210,7,免疫脾细胞的制备:,1-2,10,8,无

5、菌手术,饲养细胞:,常用小鼠腹腔巨噬细胞,,5-810,6,分泌细胞生长因子,吞噬衰老细胞和微生物,存活一般不超,2,周,不影响杂交瘤细胞的纯化,杂交瘤细胞的选择性培养,细胞,DNA,合成途经:,1.替代途径:次黄嘌呤(,H),HGPRT,2.主要途径:,氨基酸 鸟嘌呤核苷酸,谷氨酰胺 (,A-),尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸,TK,3.次要途径:胸腺嘧啶核苷(,T),HAT,培养基:,H,(,Hypoxanthine,),:,次黄嘌呤,A,(,Aminopterin,):,氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断,DNA,合成主要途径,T(Thymidine),:,胸,腺嘧啶核苷;,“,核苷酸前体,”,,

6、供细胞通过替代途径合成,DNA,HAT,选择培养基的原理,HAT,选择作用:,淋巴细胞:,不能生长,,5,7,天死亡;,DNA,合成的主要途径被,A,阻断,骨髓瘤细胞:,不能生长,,5,7,天死亡;,HGPRT,缺乏,,DNA,合成的替代途径受阻,克隆化:,指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌,细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。,克隆化的原则:,尽早进行,反复4-5次,阳性杂交瘤细胞的克隆化,有限稀释法,(limiting dilution),软琼脂平板法,(soft agar method),单细胞显微操作法,(micromanipulation),荧光激

7、活细胞分类法法(,fluorescence activated cell sorter,,,FACS,),克隆化方案:,特点:,不需任何特殊设备,克隆出现效率高,实验室常用方法,方法:,细胞悬液通过系列稀释,每个培养孔含,0.5,1,个细胞,有限稀释法,在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时,细胞培养过程中随时可能发生细胞污染,分泌抗体能力丧失等,“,慢冻,”,:,分步冷冻,,30-70,液氮,“,快融,”,:,取出立即浸入,37,40,水浴中,使其迅速融化、复苏,杂交瘤细胞的冻存与复苏,防止污染,避免染色体丢失,防止非分泌细胞的过度生长,防止细胞密度过高而死亡,细胞冷冻的意义,杂交瘤细胞检定,

8、1.,抗体分泌稳定性,抗体连续传代法,-,保持稳定分泌特异性抗体,2.,细胞核学特征,检查细胞分裂中期染色体,-,保证不丢失产生抗体基因的染色体,3.,鼠源病毒检查,细胞试验,动物抗体产生试验,鸡胚感染试验等,-,排除单抗制品的病毒污染,4.,支原体检查,荧光染色法,培养法,分子生物学法等,防止污染,5.,无菌试验,直接接种法,薄膜过滤法,二 单克隆抗体的制备,经过反复克隆化获得的,抗体阳性杂交瘤细胞株,应立即扩大培养(除及时冻存的细胞外)。因多次传代易引起,染色体逐渐丢失,而使细胞,产生抗体能力,逐渐减弱甚至消失,还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。,动物体内诱生方法:,操

9、作简便,经济,主要用于生产科研或诊断用单抗,腹水浓度可达,2-5mg/ml,实体瘤法、腹水制备法,体外培养法:,使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,工艺简单、易控制,可大规模生产,浓度不高,,200-500ug/ml,悬浮培养法、固相培养法,单克隆抗体的产生,腹水制备法,预先腹腔注射降直烷或液状石蜡,1-2,周后注射(,1,5,),10,6,细胞,1,3,w,形成腹水,5-20mg/ml,1-10ml,高滴度腹水,抗体特异性鉴定:,抗原类似物的交叉反应,Ig,类型、亚类鉴定:,双扩法或,ELISA,法,McAb,中和活性鉴定:,动物或细胞的保护实验,McAb,识别抗原表位测定:,用竞,争结合法,

10、测相加指数法,McAb,亲和力测定:,ELISA,单克隆抗体性质鉴定,注意事项,1.,污染,细菌,真菌,支原体,2.,杂交瘤细胞不分泌或停止分泌抗体,HAT,中,A,失效;,免疫原的抗原性弱,免疫效果差;,支原体污染;,抗体非分泌细胞竞争性生长;,染色体丢失,预防措施,1.,大量保持和补充液氮冻存的细胞原管;,2.,倒置显微镜经常检查细胞生长状况;,3.,不让细胞“过度生长”,4.,不让培养物不加检查任其连续培养几周或几月;,抗体的纯化:,硫酸铵沉淀,凝胶过滤法,离子交换层析,亲和层析,硫酸铵沉淀,大量的盐加入到蛋白溶液中,高浓度的盐离子有很强的水化力,可夺取蛋白质的水化层,使蛋白质胶粒失水发

11、生凝聚而沉淀析出,血清,50%饱和度硫酸胺,上清(清蛋白)沉淀(球蛋白),33%饱和度硫酸胺,上清 沉淀,拟球蛋白,r,球蛋白,凝胶过滤法,干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒,将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时,大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内,留在胶粒间隙的溶液中,随洗脱液最先流出,小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内,受到凝胶的阻留,向下移动较慢洗脱出来较慢,据此将不同大小的蛋白质分离出来。,交联葡聚糖凝胶(,Sephadex),琼脂糖凝胶(,Sepharose),离子交换层析法,DEAE,纤维素:结合溶液中带负电荷的蛋白质,又称阴离子交换剂,CM,纤维素:结合溶液中带正电荷的蛋白质,又称阳离子交换剂,亲和层析法,将抗原(或抗体)连接到固相载体上,特异性吸附液相中的抗体(或抗原),形成抗原抗体复合物,然后改变条件,使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体(或抗原)。,A,蛋白-,Sepharose CL 4B,三、单克隆抗体的应用,检验医学诊断试剂,(1)病原微生物抗原抗体的检测,(2)肿瘤抗原的检测,(3)免疫细胞及其亚群的检测,(4)激素测定,(5)细胞因子的测定,蛋白质的提纯,肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术,THANKS!,

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