病毒转基因技术原理腺相关病毒.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,病毒转基因技术原理腺相关病毒,第一节 腺相关病毒简介,生物学特性,致病性与免疫性,第一部分 生物学特性,血清型,病毒结构,病毒复制,对理化因素的抵抗力,血清型,AAV,是从腺病毒的污染物（,1965,年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。,共鉴定了,11,个,AAV,血清型以及,108,个,AAV,变株（,variants,）。,通过签名,PCR,（,signature PCR,）技术，利用高度保守序列扩增,Cap,基因的一小段可变区的,DNA,序列，以筛检是否是新的,AAV,分离株，然后利用,PCR,技术获得新的,AAV,分离株的,Cap,或（和）,Rep,基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的,AAV,的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。,AAV,不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与,AAV-2,型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。,50 80%AAV-2,抗体在人群中检测出。,转导不同组织器官的,AAV,最优血清型,不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（,tissue tropisms,）,病毒结构,AAV-2,2030 nm,，基因组为线性、单链的,DNA,分子。正链和负链的单链,DNA,分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长,4679,个核苷酸。,基因组包括两个,ORF,，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为,p5,、,p19,和,p40,启动子），以及两末端为,145,个核苷酸的反向末端重复序列（,inverted terminal repeat,，,ITR,）,ITR,ITR,中的前,125,个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成,T,字形的发夹结构；剩余的,20,个核苷酸，保持非配对状态，称为,D,序列（,D sequence,）。,ITR,中还具有,Rep,结合元件（,Rep binding elements,，,RBEs)RBE,和,RBE,，以及一个末端解离位点,TRS,（,terminal resolution site,）等重要序列。,ITR,是在,AAV,生物学中重要的顺式（,cis,）作用活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，,ITR,在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。,ITR,对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。,左端的,ORF,（,Rep,基因）,可编码四个,Rep,蛋白，即,Rep78,，,Rep68,，,Rep52,和,Rep40,，均具有螺旋酶和,ATP,酶活性。较大的,Rep,蛋白如,Rep78,和,Rep68,，由,P5,启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在,TRS,附近）以及位点特异的,DNA,结合活性（结合于,RBE,）。因此它们是重要的调节蛋白，以反式（,trans,）方式参与调节,AAV,复制周期的所有阶段，如,DNA,复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的启动子等。,较小的,Rep,蛋白如,Rep52,和,Rep40,，由,P19,启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链,DNA,的聚集并包装入病毒体的衣壳。,右端的,ORF,（,Cap,基因）,由,P40,启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白，即,VP1,，,VP2,和,VP3,。,这些衣壳蛋白利用共同的,ORF,，但转录起始位置不一致。,一般而言，,VP1,、,VP2,和,VP3,的分子比是,1,：,1,：,8/10,。,构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染性，尤其是,VP1,含量低的情况下。缺乏,VP1,的病毒体没有感染性。,病毒复制,八个主要步骤：,与细胞表面受体黏附或结合,内吞（,endocytosis,）,在细胞内经内吞体运输,释放出内吞体,进入胞核,脱壳并释放病毒基因组,启动双链,DNA,的合成,整合到细胞染色体或以附加子形式持久表达病毒基因,不同血清型的,AAV,感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的,AAV,靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径,AAV,病毒的糖苷受体和辅助受体,AAV,病毒基因组的复制模型左为,RFm,，右为,RFd,）,Rep,蛋白,AAV,成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存在的情况下：裂解阶段（,lytic stage,）和溶原性阶段（,lysogenic stage,）,AAV,的复制周期可以分为两个阶段,溶原性阶段（,lysogenic stage,）,:,在缺乏辅助病毒如,AdV,、,HSV,等感染的情况下，,AAV,几乎不能复制，基因表达受到抑制，,AAV,基因组会整合到染色体,q13.4,的一个,4kb,大小的区域（命名为,AAVS1,），建立潜伏感染,裂解阶段（,lytic stage,）,:,在辅助病毒如,AdV,、,HSV-1,等共同感染的情况下，,AAV,可以经历核酸复制、病毒基因表达和病毒体产生等过程，最终形成产毒性感染,受到羟基脲、拓扑异构酶抑制剂或紫外线照射等处理，在缺乏辅助病毒的情况下，也可以刺激,AAV,的复制。,AAV,的复制在某些细胞也可以自发发生。,染色体,q13.4,的,AAVS1,位点中最少,33bp,的序列，包含由,8,个核苷酸分开的,RBE,样和,TRS,样序列，对,AAV,的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特异性的整合过程即使是在,Rep78,和,Rep68,蛋白理想表达的条件下，未必是完全是位点特异的，大约,40-70%,的整合发生在,AAVS1,位点,溶原性阶段（,lysogenic stage,）,AdV,能提供辅助功能的基因有,E1a,，,E1b55K,，,E2a,，,E4orf6,和,VA RNA,（,viral associated RNA,）。,HSV-1,能提供辅助,AAV,复制功能，至少涉及,HSV-1,的复制蛋白，包括,helicase/primase complex(UL5,UL8,和,UL52),和,DNA,结合蛋白,ICP8,（,UL29,）。,裂解阶段（,lytic stage,）,对环境理化因素的抵抗力,AAV,对理化因素如温度和,pH,的抵抗力强。,对化学消毒剂如,1,的次氯酸钠、,2,戊二醛、,0.25,十二烷基硫酸钠等敏感。,第二部分 致病性与免疫性,约,80%,的人群的血清抗,AAV,抗体阳性，这些抗体针对的血清型是,AAV-1,，,2,，,3,和,AAV-5,型。,但针对,AAV,在人群自然感染史的认识非常少，且未发现这些感染导致临床典型的病理改变或疾病。,蛋白表达型腺相关病毒载体,基因打靶型腺相关病毒载体,rAAV,的纯化和定量,三成分包装系统,自我互补型,AAV,载体（,self-complementary AAV vector,，,scAAV,）,反式剪接型,AAV,载体（,trans-splicing AAV vector,tsAAV,）,衣壳蛋白修饰型,AAV,载体,第二节 腺相关病毒载体转基因技术原理,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,三成分包装系统,:,重组,AAV,病毒体（,rAAV,，,ssAAV,Sigle-stranded AAV,）的组装，必须依赖于三种成分，即：转移载体，由转基因表达读框以及两侧的野生型,AAV,的,ITR,区组成；,AAV,的,cap,和,rep,编码序列；辅助病毒功能,建立了各种各样的方法和细胞培养系统以制备,rAAV,，并且这些方法和培养系统还在不断完善之中,目前最常使用的,rAAV,载体系统是二,(,或三,),质粒转染,HEK293,法,(two/three plasmid transfection of adherent HEK293 cells),，包括,rAAV,转移载体，,rAAV,辅助质粒和,(,或,),辅助病毒质粒三部分,三成分包装系统,:,rAAV,转移载体仅保留野生型,AAV,基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件,基因组两端的,ITR,序列；全部去掉,rep,和,cap,基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。实际包装外源基因的上限仅为,4.4kb,。,rAAV,辅助质粒是克隆的,ITR,缺失的野生型,AAV,的基因组，以反式方式提供,rep,和,cap,基因编码蛋白的功能。目的在于病毒包装过程中，避免野生型,AAV,病毒的形成。,AdV,辅助病毒质粒，包括其起辅助功能的基因,E2a,，,E4orf6,和,VA RNA,。,E1a,和,E1b55K,可由,HEK293,细胞提供。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,三成分包装系统优点,:,三成分包装系统不足,:,快速、有效，,避免了辅助病毒的使用,当,rAAV,用于心脏、肝脏和骨骼肌等器官时，制备大量的,rAAV,耗时、耗力,采用大规模悬浮细胞培养技术可克服这一障碍，并研制了三种替代的方法,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,三成分包装系统的大规模悬浮细胞培养技术,:,采用重组杆状病毒表达系统,BEVS,（,baculovirus expression vector system,），提供三种成分并感染昆虫细胞或利用包含,cap,和,rep,的稳定包装昆虫细胞系；,包含,cap,和,rep,的稳定包装哺乳动物细胞系，并通过感染,AdV,提供辅助功能；,利用哺乳动物细胞系和重组,HSV-1,提供,cap,和,rep,，,rAAV,和辅助功能。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,策略,2,constructed Ad helper plasmids that are cotransfected onto,E1a,/,E1b,-expressing 293 cells along with a plasmid that expresses the,rep,and,cap,genes and a vector plasmid,60C,30 min,Forty-eight to seventy-two hours after transfection,Ad is inactivated by heat treatment,自我互补型,AAV,载体（,self-complementary AAV vector,，,scAAV,重组,AAV,（,ssAAV,）进入细胞后，在启动蛋白表达之前，重要的限速步骤是单链基因组需要转换成为双链基因组。,McCarty,等缺失了,rAAV,的一个,ITR,区的,TRS,（,trs,），阻止其突变末端参与复制的启动，最终形成一个呈现串联的、单链的反向重复的基因组，其两端是野生型的,ITR,，但中间一个是突变型的,ITR,。,脱出衣壳后，将以中间突变的,ITR,为基础折叠形成发夹结构，形成自我互补的双链，因此，在组织或体外实验中可以快速和高效表达。,这种类型的,scAAV,的包装能力仅为,ssAAV,的一半，大约,2.3kb,。,最近的进展是利用,scAAV,表达小干扰,RNA(siRNA,，,small-interference RNA),。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,自我互补型,AAV,载体（,self-complementary AAV vector,，,scAAV,）,由于,ssAAV,和,scAAV,载体的包装容量均有限，限制了在基因治疗领域的应用。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,反式剪接型,AAV,载体（,trans-splicing AAV vector,tsAAV,）,单链线性,AAV DNA,的自由末端以头,-,尾相接的形式经分子间内重组形成的串联的二聚体（,concatemers,），介导,AAV,在特定组织,(,如肌肉,),中的非整合性长效表达。,利用此原理，将一个较大的外源基因拆分成两个部分，分别包括剪接供体位点,SD,（,splice donor sites,）和剪接受体位点,SA,（,splice acceptor sites,），建立两个不同的,rAAV,载体或不同亚型的,ITR,杂交载体，即反式剪接型,AAV,载体；,共感染靶细胞后，可以指导两个外源基因片段形成首尾拼接的异二聚体、经正确剪接后形成完整的基因而获得表达。,该型载体可克服包装容量的限制，可达,9kb,，并成功在肺脏、肌肉和视网膜等表达。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,自我互补型,AAV,载体（,self-complementary AAV vector,，,scAAV,）,总体而言，反式剪接型,AAV,载体较,ssAAV,低效。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,衣壳蛋白修饰型,AAV,载体,交叉包装型,AAV,载体（,cross-packaging AAV vector,）：利用同一,AAV,载体的基因组包装入不同血清型的衣壳，便于直接比较不同的血清型以及在体内的组织极性的差异，为了利用不同衣壳的组织极性而有目的改造。,镶嵌型载体（,mosaic vectors,）：将不同血清型的衣壳按照不同比例混合。,嵌合型病毒体（,chimeric virions,）：将不同血清型的,VP,蛋白重新联合形成。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,衣壳蛋白修饰型,AAV,载体,免疫逃避载体：分子进化方法如,DNA,洗牌（,DNA shuffling,）和易错,PCR,（,error-prone PCR,）等技术构成的突变衣壳蛋白库，然后直接进行定向筛选抵抗中和抗体、或具有特定受体亲和性、或细胞嗜性的,rAAV,，或者经位点导向的突变（,site-directed mutagenesis,）、特异肽端插入（,peptide insertion,）和化学接合（,chemical conjugation,）等方法,细胞靶向特异性,AAV,载体,(target specific AAV vector),：利用不同细胞表面的特定受体，对AAV,衣壳蛋白进行插入突变或缺失，导致配体改变,组织特异性,AAV,载体（,tissue-specific AAV vector,：利用特定组织细胞表达的启动子，以实现靶向特定组织如肌肉、肺脏和肿瘤等,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,第二部分 基因打靶型腺相关病毒载体,野生型,AAV-2,在,Rep,的作用下，定点整合于人,19,号染色体的,AAVSl,位点。,重组,AAV,不含,rep,基因，定点整合的可能性极度下降。,可以通过高,MOI,感染以及对细胞敏感的血清型的衣壳包装，可能增加,AAV,的单链,DNA,入核并与细胞染色体发生重组的几率。基因打靶型,AAV,载体依赖于,DNA,的双链断裂,(double strand break,，,DSB),，,AAV,可通过同源重组修复,DNA,双链可介导包括插入、缺失、点突变等多种遗传修饰的细胞内的基因打靶。,因此，基因打靶型,AAV,载体重点在于设计，载体序列与染色体靶基因序列的同源臂的匹配长度，将载体上待突变的基因放在中央。,35%,的感染细胞可以发生整合，显著高于转染或电穿孔方式获得的基因打靶频率，且在打靶中,AAV,介导的基因表达可以长期持续、并具有高度的保真性。,rAAV,载体应用于基因校正、基因阻断治疗疾病或生产转基因家畜、用于农业和研究的大型动物等具有无可比拟的优势，如：介导的基因打靶的效率高达,1,、高于质粒载体转染或电转化，宿主范围广泛，可利用的多种亚型等。主要缺陷是大约,10,仍是随机整合、具有潜在的致死或致癌效应。研究显示可采用成体干细胞并在体外筛选特异打靶克隆用于疾病治疗。,第二部分 基因打靶型腺相关病毒载体,策略,3,细胞内整合表达,纯化（,三种方法）,离子交换色谱法（,IEX chromatography,）：原理是依据在某一,PH,条件下，不同血清型的,AAV,的衣壳蛋白的电荷不同，因而，可以利用这一技术将不同的血清型的,AAV,分离纯化,.,优势,:,具有快速、规模化、可重复性以及适用于不同血清型病毒纯化的。,缺点,:,在于需要摸索盐和,PH,浓度，以利于,AAV,病毒颗粒结合于,IEX,离子柱，而且这些条件依据不同的血清型而有所变化；另外常需要多步骤才能获得高纯度的,rAAV,。,第三部分 纯化和定量,纯化（,三种方法）,受体特异性的亲和纯化（,Receptor-specific affinity purification,）：,Heparan sulfate proteoglycan(HSPG),是,AAV-2,感染细胞的受体，因此肝素亲和色谱分析法（,Heparin affinity chromatography,）利用,AAV-2,和细胞特定受体结合这一特点，进行,AAV-2,的纯化，可获得高滴度和高纯度的纯化产物并可以用于临床试验，这也是,rAAV-2,在临床试验中作为使用最广的原因之一。依据同样原理，,mucin,被作为亲和配体以纯化,AAV-5,。,缺点是不同的血清型的受体不同，因此，适用范围较窄。,第三部分 纯化和定量,纯化（,三种方法）,AVB,葡聚糖凝胶亲和色谱法：以,AAV,衣壳中高度保守的表位为基础，制备的单链抗体（,14 kDa,）并在酵母中表达纯化后铰链到葡聚糖凝胶，以纯化,AAV,的多个血清型（如,AAV-1,，,2,，,3,，,5,和,8,）。,第三部分 纯化和定量,定量,采用含,Rep/cap,基因的细胞并接种于,96,孔细胞培养板，用,AdV,辅助病毒感染后，系列稀释的,rAAV,接种并用,TCID50,计算终点滴度，同时联合作为标准检查病毒基因滴度的,qRT-PCR,技术。,或采用,rHSV,表达,Rep/cap,基因作为辅助病毒的方法，可选用更多的细胞类型用于定量。,第三部分 纯化和定量,具有复制能力的,rcAAV(replication-competent AAV),需要对终产物检测是否具有复制能力的,rcAAV(replication-competent AAV),，这通常是由于载体与细胞系或辅助质粒中存在互补序列造成，可影响病毒载体的表达。,常将,rAAV,制备物稀释后感染,293,细胞（或其它缺乏,AAV,基因的合适细胞），并在辅助病毒存在情况下作用,48,或,72 h,，仅其中的,rcAAV,才能复制，收集细胞，冻融后的产物重复感染,293,细胞,2,次以上，用针对,AAV,的,ITR,区和,rep,基因的引物进行,qRT-PCR,检测。,第三部分 纯化和定量,第三节 腺相关病毒载体的医学应用,生物医学的各种基础研究,基因治疗,病毒学和分子生物学,体内基因转移和表达研究,rAAV,载体的构建、生产和功能评价，临床前研究，人体临床试验，离体细胞水平的临床前和临床研究,肿瘤治疗,rAAV,载体的生物分布和应用途径,与细胞和基因治疗等的相关研究,rAAV,载体的,DNA,在细胞内常存在于染色体外，而且在体内持续存在的时间较长，可以持久表达外源基因,基因治疗,单基因遗传病,肿瘤,神经系统疾病,视网膜疾病,心血管疾病（心衰）,关节炎,慢性紊乱,传染性疾病,Glybera(alipogene tiparvovec)became the first gene therapy drug to be approved for commercial use in The European Union,what does Glybera do and how does it work?Its been approved for patients with the rare(one in 1,000,000 people)autosomal recessive lipoprotein lipase(LPL)deficiency.Without LPL,these patients have significantly increased levels of chylomicrons that carry fat throughout the body.Accumulation of these chylomicrons in the pancreas can lead the the often painful and potentially fatal condition pancreatitis.,Glybera is capable of doing this by encasing the correct LPL gene in an adeno-associated virus(AAV-1)which hones in on muscle cells.When the AAVs reach their target,they deliver the gene and within a few weeks functional protein is being produced.In clinical trials uniQure found that the therapy was well-tolerated by 27 LPLD patients and within 3-12 weeks after a single-dose injection nearly all of their patients had lower serum lipid concentrations and reduced incidence of pancreatitis.,总结：腺相关病毒载体的优势,外源基因可整合到人细胞基因组中实现长期稳定表达；,可感染包括非分裂期细胞在内的多种细胞；,载体的免疫原性和毒性低，,无致病性，安全性好；,病毒滴度高达,10 10pfu,ml,，易于制备和纯化,总结：腺相关病毒载体的缺点,载体的容量相对较小,(4.5kb),；,与宿主染色的整合是一种随机整合,复习思考题,腺相关病毒的生物学特性。,腺相关病毒载体的构建原理和规模化制备策略。,腺相关病毒载体的医学应用。,