MMM-第二代测序技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、,Sanger,双脱氧链终止法原理,加入特殊核苷酸底物,双脱氧核苷三磷酸（,ddNTP,），与普通,dNTP,不同，在脱氧核糖的,3,位置缺少一个羟基，不能形成磷酸二酯键。,例如，存在,ddCTP,、和四种,dNTP,（其中一种为,-,32,P,标记）的情况下，将引物、模板和,DNA,聚合酶一起保温，即可形成以,ddC,残基为,3,端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的,DNA,链中,C,的分布提供准确信息，从而将全部,C,的位置确定下来。,采用类似的方法，在,ddATP,、,ddGTP,和,ddTTP,存在的条件下，可同时制得分别以,ddA,、,ddG,和,ddT,残基为,3,端结尾的三组长短不一的片段。,将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。,循环测序反应原理示意图,测序峰图的简单分析,我们所用的峰图分析软件为：,Sequence Scanner V 1.0,，,Bioedit,等,DNA,测序仪的发展,平板凝胶电泳 毛细管电泳,Simple Gel Loading,Long ReadIR DNA Sequencer,Gene ReadIR DNA Analysis System,B,IOTECHNOLOGY,D,IVISION,AB,公司DNA分析仪大家族,平板凝胶电泳式：,377-36,377-96,毛细管电泳式：,310,3100,和,3700,，,3730XL,ABI PRISM,377 DNA Sequencer,ABI P,RISM,377,测序仪,ABI P,RISM,310,遗传分析仪,ABI P,RISM,3100,遗传分析仪,ABI P,RISM,3700,遗传分析仪,ABI P,RISM3730,遗传分析仪,二、第二代高通量测序技术简介,四大高通量测序平台,Solexa,，,454(GS-FLX),，,SOLiD,和,Polonator,测序原理,合成法测序,(Sequencing by Synthesis),连接法测序,(Sequencing by Ligation),(,一,)454(GS-FLX),Roche,：（,2005,，,2007,，,2008,）,原理：在,DNA,聚合酶、,ATP,硫酸化酶、荧光素酶,和,双磷酸酶,的作用下，将每一个,dNTP,的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测,DNA,序列的目的。,Roche GS FLX System,是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“,Pico TiterPlate”,（,PTP,）的,平板,，它含有,160,多万,个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的,各种酶和底物,。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照,T,、,A,、,C,、,G,的顺序依次循环进入,PTP,板，每次只进入一个碱基。,如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，,最终将荧光素氧化成氧化荧光素，,同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD,捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。,454,测序流程,454,测序流程与,Base Calling,每次加入一种碱基，再对荧光强度进行读取，如果不能和加入碱基配对则没有信号，如果有单个碱基配对则可检测到一倍的信号，如果有连续多个可配对碱基则可检测到多倍强度的荧光信号，荧光强度和碱基个数成正比。,454(GS-FLX),流程,1,、文库制备：基因组,DNA/cDNA,片段化处理至,300-800bp,间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的,DNA,。,454(GS-FLX),流程,2Emulsion PCR,：单链,DNA,文库被,固定,在,DNA,捕获磁珠上，,乳化,，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的,扩增，,回收纯化；,454(GS-FLX),流程,3,、测序反应：携带,DNA,片段的磁珠被放入,PTP,板中供测序反应使用。,454(GS-FLX),流程,4,、数据分析：,GS FLX,系统在,10,小时的运行当中可获得,100,余万个读长，读取超过,4-6,亿个碱基信息,454,的特点与主要应用,读长较长，,400,600bp,通量较低，,1Run 1M,序列，,400,600Mb,相对成本较高,主要应用：,de novo,测序,二）,Solexa-Illumina Genome Analyzer,核心技术：“,DNA,簇”和“可逆性末端终止”。,原理：将基因组,DNA,的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即,Flow cell,），这些,DNA,片段经过延伸和桥式扩增后，在,Flow cell,上形成了数以亿计,Cluster,，每个,Cluster,是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带,荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,，通过可逆性终止的,SBS,（边合成边测序）技术对待测的模板,DNA,进行测序。,Illumina Solexa,简介,桥式,PCR,边合成边测序,可逆终止物,HiSeq 2000,Illumina Solexa,测序流程,Illumina Solexa,桥式,PCR,diol,diol,1,st,cycle,denaturation,1,st,cycle,annealing,diol,diol,n=35,total,1,st,cycle,extension,diol,diol,diol,diol,2,nd,cycle,denaturation,2,nd,cycle,annealing,diol,diol,diol,diol,diol,diol,2,nd,cycle,extension,Illumina Solexa Base Calling,1,2,3,7,8,9,4,5,6,T T T T T T T,G,T,T,G,C,T,A,C,G,A,T,Solexa,的特点与主要应用,读长较短，,100,150bp,通量高，,25G,每天，,120-150G,每,Run,主要应用：,RNA,测序、表观遗传学研究,（三）,SOLiD,ABI(Applied Biosystems),：,SOLiD(,S,equencing by,O,ligonucleotide,L,igation and,D,etection),原理：用连接法测序获得基于“,双碱基编码原理,”的,SOLiD,颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的,reference,序列，把,SOLiD,颜色序列定位到,reference,上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在,SNP,位点。,SOLiD,S,equencing by,O,ligo,Li,gation/,D,etection,Oligo,连接测序：通过连接酶连接，再对,oligo,上荧光基团进行检测,SOLiD 5500 xl,ABI SOLiD,测序原理,单向,SOLiD,测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应。第一轮测序的第一次连接反应由连接引物“,n”,介导，由于每个磁珠只含有均质单链,DNA,模板，所以这次连接反应掺入一种,8,碱基荧光探针，,SOLiD,测序仪记录下探针第,1,2,位编码区颜色信息，随后的化学处理断裂探针,3,端第,5,、,6,位碱基间的化学键，并除去,68,位碱基及,5,末端荧光基团，暴露探针第,5,位碱基,5,磷酸，为下一次连接反应作准备。因为第一次连接反应使合成链多了,5,个碱基，所以第二次连接反应得到模板上第,6,、,7,位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第,11,、,12,位碱基序列的颜色信息,SOLiD,流程,1,、,SOLiD,基因组文库的构建,SOLiD,流程,2,、油包水,PCR,SOLiD,流程,3,、含,DNA,模板,P1,磁珠的固定,SOLiD,流程,4,、,SOLiD,双碱基编码原理及测序流程,SOLiD,流程,4,、,SOLiD,双碱基编码原理及测序流程,Solexa,的特点与主要应用,读长较短，,100,150bp,通量高，,25G,每天，,120-150G,每,Run,主要应用：,RNA,测序、表观遗传学研究,SOLiD,的特点与主要应用,读长较短，,50-75bp,精度高，可达,Q40,通量高，,20-30G,每天，,1Run,可达,120G,主要应用：基因组重测序、,SNP,检测等,（四）,Polonator,测序原理：,Polonator,系统高质量测序是一种以,连接反应,进行,DNA,序列分析的技术，该系统采用结合在,磁珠,上单分子,DNA,片段簇,为测序模板，以,CY5,、,Texas Red,、,CY3,、,6-FAM,四色荧光标记,的,9,碱基单链荧光探针混合物进行连续的连接反应为基础，对扩增的,DNA,片段进行大规模高通量测序。,Polonator,流程,三、高通量测序应用,DNA,测序,全基因组,de novo,测序基因组重测序宏基因组测序,人类外显子组捕获测序,RNA,测序,转录组测序小,RNA,测序电子表达谱测序,表观基因组研究,ChIP-SeqDNA,甲基化测序,基因组测序,基因组测序是对物种的,基因组,DNA,打断后进行高通量测序，根据是否有已知基因组数据主要分为,de novo,全基因组测序和,基因组重测序,。,De novo,基因组测序是对,未知基因组序列,的物种进行基因组从头测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组图谱。,全基因组重测序是对,已知基因组序列,的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。,基因组测序策略,Paired-End,Mate-End,基因组测序流程两种测序策略,Paired-end,原理,49,100bps,100bps,3000bps,Paired-end,基因组重排分析,Paired-end,和测序深度对测序效果的影响,Jun Wang,et al.Nature,456,60-65(6 November 2008),基因组测序的生物信息学分析,数据产出处理,：图像识别与,Base Calling,去除接头序列、检测与去除污染序列等；,基因组组装,：原始数据统计、测序深度分析、组装结果统计等；,基因组注释,：,Coding Gene,注释、,RNA,分类注释、重复序列注释等；,基因功能注释,：,GO,功能分类、,Interpro,功能分类等；,比较基因组及分子进化分析,：,SNP/InDel/CNV,检测等。,References,1,、,Erin D.Pleasance,Philip J.Stephens,Sarah O,Meara,et al.A small-cell lung cancer genome with complex signatures of tobacco exposure.,Nature,2010,463:184-190.,2,、,Michael James Clark,Nils Homer,Brain D.O,Connor,et al.U87MG Decoded:The Genomic Sequence of a Cytogenetically Aberrant Human Cancer Cell Line.PloS Genetics,2010,6(1):e1000832.,3,、,Wei Chen,Reinhard Ullmann,Claudia Langnick,et al.Breakpoint analysis of balanced chromosome rearrangements by next-generation paired-end sequencing.European Journal of Human Genetics,2010,18:539-543.,4,、,Van Tassell CP,Smith TP,Matukumalli LK,Taylor JF,Schnabel Rd,et al.Whole-genome sequencing and variant discovery in C.elegans.Nat Methods,2008,5(2):183-188.,5,、,Jun Wang,Wei Wang,Ruiqiang Li,et al.The diploid genome sequence of an Asian individual.Nature,456,60-65(6 November 2008),6,、,Huang SW,Li RQ,Wang J,et al.The Genome of the Cucumber(Cucumis sativus Linnaeus).,Nature Genetics 2009;doi:10.1038/ng.475,7,、,David Hernandez,et al.De novo bacterial genome sequencing:Millions of very short reads assembled on a desktop computer.Genome Res.,2008.18:,802-809,53,基因组重测序案例分析,Erin D.Pleasance,et al.The compendium of somatic mutations in a small-cell lung cancer genome.,Nature,2010,463:184-190.,此研究用高通量测序对一个,小细胞肺癌,细胞系,NCI,H209,基因组进行重测序，以探讨吸烟引发该细胞系基因组中特定碱基及其周围序列的突变及细胞损伤修复原理。,肺癌基因组变异情况统计图,基因组重排和,CNV,分析,从头基因组测序案例,David Hernandez,et al.De novo bacterial genome sequencing:Millions of very short reads assembled on a desktop computer.,Genome Res.,2008.18:,802-809,此研究对,Staphylococcus aureus,strain MW2,和,Helicobacter acinonychis,strain Sheeba,两种细菌基因组进行从头测序，并比较了几种拼接方法的效果。,多种拼接软件拼接结果比较,多种拼接软件拼接结果比较,五种拼接方法的拼接结果比对,宏基因组测序,宏基因组测序是对某一特定环境，如肠道、土壤、海水等中的所有微生物进行基因组测序。通过此方法可对该环境中的微生物种类和优势物种进行检测，揭示微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。自然环境中很多微生物无法分离培养，而此方法无需对微生物进行分离培养。,宏基因组测序方法现在有全基因组的宏基因组测序和,16S/18S rRNA,宏基因组测序。,全基因组的宏基因组测序,通过高通量测序技术，对环境样品的总,DNA,直接进行全基因组的宏基因组测序，能够实现微生物群落的物种分类研究、群落结构、系统进化、功能注释以及物种间的代谢网络研究，挖掘具有应用价值的基因资源，开发新的微生物活性物质。与传统的,Sanger,法相比，速度快，性价比高，周期短，单个样品的测序量可以接近饱和。,宏基因组测序信息分析主要内容,拼接组装,物种分类组成分析,基因预测和功能注释,生成,Profiling table,主成分分析（,PCA,）,筛选与样品分组显著相关的因子,多样品间比较分析,16S/18S rRNA,宏基因组测序,16S/18S,rRNA,是微生物群落分析和细菌进化研究以及分类研究最常用的靶分子，采用新一代测序技术，对,16S/18S rDNA,的可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，能全面的反映微生物群体的物种组成，真实的物种分布及丰度信息。,16S/18S rRNA,测序信息分析内容,物种分类、物种丰度分析,OTU,（,Operational,Taxonomic Units,）分析,多样性分析,系统进化分析,多样品间的比较分析,References,Meyer,F;Paarmann D,DSouza M,Olson R,Glass EM,Kubal M,(2008).The metagenomics RAST server-a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes.,BMC Bioinformatics,9,:0.,doi:10.1186/1471-2105-9-386.,George I et al.(2010).Application of Metagenomics to Bioremediation.,Metagenomics:Theory,Methods and Applications,.Caister Academic Press.,Wong D(2010).Applications of Metagenomics for Industrial Bioproducts.,Metagenomics:Theory,Methods and Applications,.Caister Academic Press.,Nelson KE and White BA(2010).Metagenomics and Its Applications to the Study of the Human Microbiome.,Metagenomics:Theory,Methods and Applications,.Caister Academic Press.,CharlesT(2010).The Potential for Investigation of Plant-microbe Interactions Using Metagenomics Methods.,Metagenomics:Theory,Methods and Applications,.Caister Academic Press.,Allen,EE;Banfield,JF(2005).Community genomics in microbial ecology and evolution.,Nature Reviews Microbiology,3,(6):489,498.,Zheng,Hao;Wu,Hongwei(2010).Short prokaryotic DNA fragment binning using a hierarchical classifier based on linear discriminant analysis and principal component analysis.,J Bioinform Comput Biol.,8,(6):995,1011.,人类外显子组捕获测序,外显子组是指全部,外显子区域,的集合，该区域包含合成蛋白质所需要的重要信息，涵盖了与个体表型相关的,大部分功能性变异,。,与全基因组重测序相比，外显子组测序只需针对外显子区域的,DNA,，,覆盖度,更深、数据,准确性,更高，更加简便、,经济,、高效。,66,人类外显子组捕获测序原理,人类外显子组捕获测序分析流程,检测序列变异分析示例,检测到,SNP,数统计,序列,InDel,检测,References,1,、,Wei X,Walia V,et al.,Exome sequencing identifies GRIN2A as frequently mutated in melanoma.Nat Genet.,2011 Apr 15.Epub ahead of print,2,、,Janel O.Johnson,J.Raphael Gibbs,et al.Exome Sequencing in Brown-Vialetto-Van Laere Syndrome.Am J Hum Genet.,2010 October 8;,87(4):567,569.,3,、,Teer JK,Mullikin JC.Exome sequencing:the sweet spot before whole genomes.Hum Mol Genet.,2010 Oct 15;19(R2):R145-51.Epub 2010 Aug 12.,4,、,Ley TJ,Mardis ER,Ding L,et al.,DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome.Nature 2008;456(7218):66-72,5,、,Gnirke A,Melnikov A,Maguire J,et al.Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing.Nat Biotechnology 2009;27(2):182-9.,6,、,Murim Choia,Ute I.Scholla,Weizhen Jia,et al.(2010)Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing.,PNAS,.106:19096-19101.,7,、,Sarah B Ng,Kati J Buckingham,Choli Lee,et al.(2010)Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder.,Nature Genetics,42,30-35.,70,人类外显子组捕获测序案例,Wei X,Walia V,et al.,Exome sequencing identifies GRIN2A as frequently mutated in melanoma.,Nat Genet,.,2011 Apr 15.Epub ahead of print,黑色素瘤,发生率一直在上升，此研究对黑色素瘤细胞进行外显子组捕获测序，发现了和其相关的,高频突变基因,。,七个新发现的非同义高频突变位点,单个基因中突变位点分析,基因,GRIN2A,模式图，箭头表示突变位点,转录组测序简介,转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有,RNA,的总和，包括,mRNA,和非编码,RNA(Non-coding,RNA),。,第二代测序系统可精确检测单个碱基，并且不受到研究中先验信息的干扰，科研人员能够快速地获得某一物种特定器官或组织在某一状态下几乎所有,mRNA,转录本序列，从而能够开展：,UTRs,区域界定,、,可变剪切研究,、,低丰度新转录本发现,、,融合基因鉴定,、,cSNP,（编码序列单核苷酸多态性）研究等。,转录组测序测序流程,全转录组总,RNA,polyT,富集,mRNA,去除,rRNA,Non-coding RNA,转录组,mRNA,RNA,片段化、纯化、检测产量,连接两端接头序列,逆转录生成,cDNA,选择适当长度,cDNA,进行扩增,纯化扩增产物，评估产量,上机进行高通量测序,转录组测序测序流程,无参考序列测序流程,有参考序列测序流程,转录组主要分析内容,无参考序列,转录组分析内容,有参考序列,转录组分析内容,1,测序数据产量统计，数据成分和质量评估；,2,Contig,及,Scaffold,长度分布,3,Unigene,的,长度分布,和,功能注释,，,GO,分类，,Pathway,分析，差异表达分析,4,蛋白功能预测与分类，,差异表达,基因,GO,富集和,Pathway,富集分析。,1,基本数据统计，,比对参考序列,2,序列在,基因组上在分布,3,测序,深度,分析、随机性评估和基因,差异表达,分析,4,新基因,预测，基因,可变剪接,鉴定和,基因融合,鉴定等。,References,Maher CA,Kumar-Sinha C,Cao X,et al.Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer.Nature,2009 Mar 5;458(7234):97-101.,Guojie Zhang,Guangwu Guo,Xueda Hu,et al.Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome.Genome Res.,2010 May;20(5):646-54.,Murchison EP,Tovar C,Hsu A,et al.The Tasmanian devil transcriptome reveals Schwann cell origins of a clonally transmissible cancer.Science.,2010 Jan 1;327(5961):84-7.,Brain B.Tuch,Rebecca R.Laborde,Xing Xu et al.Tumor Transcriptome Sequencing Reveals Allelic Expression Imbalances Associated with Copy Number Alterations.PloS ONE,2010,5(2):e9317,Fuchou Tang,Catalin Barbacioru,Ellen Nordman et al.RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.Nature Protocols,2010,ePub Febrary 25.,Sohrab P.Shah,Ryan D.Morin,Jaswinder Khattra et al.Mutational evolution in a lobular breast tumor profiled at single nucleotide resolution.Nature,2009,461:809-813,Zhao et al.,Transcriptome-guided characterization of genomic rearrangements in a breast cancer cell line.,PNAS 106(6):1886-91.(2009),Gregory R,Darby AC,Irving H,et al.A de novo expression profiling of Anopheles funestus,malaria vector in Africa,using 454 pyrosequencing.PLoS One.,2011 Feb 25;6(2):e17418.,Crawford JE,Guelbeogo WM,Sanou A,Traor,A,Vernick KD,et al.,(2010),De Novo,Transcriptome Sequencing in,Anopheles funestus,Using Illumina RNA-Seq Technology.PLoS ONE 5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202,有参考序列转录组测序案例,Maher CA,Kumar-Sinha C,Cao X,et al.Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer.,Nature,2009 Mar 5;458(7234):97-101.,此研究使用,454,和,Solexa,两种高通量测序平台对,前列腺癌,细胞系,VcaP,和,LNCaP,转录组进行测序，以检测和研究前列腺癌细胞系中,基因融合,表达情况。,基因融合分析,基因嵌合分析流程,MIPOL1-DGKB,基因融合模式,无参考序列转录组测序案例,Crawford JE,Guelbeogo WM,Sanou A,Traor A,Vernick KD,et al.,(2010),De Novo,Transcriptome Sequencing in,Anopheles funestus,Using Illumina RNA-Seq Technology.,PLoS ONE,5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202,此研究通过对,3,个,按蚊,样品进行高通量测序，通过拼接组装后，和相近物种进行,比较基因组学分析,。,De novo,序列拼接、组装和比对流程,拼接结果统计,拼接和变异检测分析流程图,比较基因组分析,各类功能基因中氨基酸在物种间差异比例,差异同源蛋白,GO,分类,进化关系分析,电子表达谱测序,对特定处理条件下的全基因组基因表达谱进行分析，已被广泛用于功能基因组学和医学等研究领域。,电子表达谱测序（,Digital Gene Expression,DGE,）又称为基因表达标签测序（,mRNA tag profiling,），其原理是通过两种,酶切,作用对基因中一段长度为,21nt,的序列标签,进行测序。由于其测序只针对表达的基因进行测序，产生的数据量相对较小，是研究基因表达谱的经济而快速的研究手段。,又称,Tag-SAGE,电子表达谱测序流程图,NlaIII,限制性酶切,电子表达谱分析内容,图像识别与原始碱基数据读取。,去污染、去接头，标签序列计数统计。,基因组比对与统计,，,基因序列比对,获得所表达的,基因列表,基因,差异表达,分析。,聚类与表达类型分析。,GO,基因富集与分类分析。,Pathway,富集与分类分析。,蛋白相互作用网络分析。,反义链转录本与,新转录本检测,。,References,Morrissy AS,et al.Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling.Genome Res.2009.19(10):1825-1835.,t Hoen PA,et al.Deep sequencing-based expression analysis shows major advances in robustness,resolution and inter-lab portability over five microarray platforms.Nucleic Acids Res,2008.36(21):e141(1-11).style7 3.Hegedus Z,et al.Deep sequencing of the zebrafish transcriptome response to mycobacterium infection.Mol Immunol,2009.46(15):2918-2930.,Audic S and Claverie JM.The significance of digital gene expression profiles.Genome Res.1997.7(10):986-995.,Zhenhua Jeremy Wu,Clifford A.Meyer,Sibgat Choudhury,et al.Gene expression profiling of human breast tissue samples using SAGE-Seq.,Genome Res.,2010.20:,1730-1739,AndreaL.Eveland,NamikoSatoh-Nagasawa,AlexanderGoldshmidt,et al.Digital Gene Expression Signatures for Maize Development.Plant Physiol.,2010,154:,1024-1039,Peter Ruzanov and Donald L.Riddle.Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.Nucleic Acids Research,2010,Vol.38,No.10,Saurabh Saha,Andrew B.Sparks,Carlo Rago,et al.Using the transcriptome to annotate the genome.Nature Biotechnology,(2002)20,508-512,电子表达谱测序案例分析,Morrissy AS,et al.Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling.,Genome Res,.2009.19(10):1825-1835.,此研究用高通量电子表达谱测序（,Tag-SAGE,）和传统,LongSAGE,测序方法对癌症细胞进行研究，比较两种方法效果，揭示了电子表达谱在基因发现中的诸多优势，可发现更多的基因，减少,GC,偏好。,两种方法所检测到的基因数比较,GC,偏好性和低丰度转录本检测效果,小,RNA,测序,小,RNA,是指长度在,21-31nt,的内源性,非蛋白质编码,RNA,，广泛存在于高等和低等生物体内，其对,mRNA,的转录及转录后水平等生命过程起到调节作用。,现已知小,RNA,可归纳成三类：微,RNA(,miRNA,),，小干扰,RNA(,siRNA,),和与,piwi,相互作用的,RNA(,piRNA,),。,miRNA,长度为,2124nt,，产生于有典型茎环二级结构的原转录本,(pri-miRNA),，在动植物的目标,mRNA,的,降解与抑制,方面发挥重要作用。,siRNA,，长度在,1925nt,，产生于长双链,RNA,，同样在动植物的目标,mRNA,的,降解与抑制,方面发挥重要作用。,piRNA,，长度,2631nt,，由与其相互作用的,Piwi,蛋白定义，目前研究表明其在,配子形成,的过程中起作用。,小,RNA,测序流程图,小,RNA,测序分析内容,基本分析：,原始数据读取，去接头、去污染序列，长度分布统计，基因组比对等。,高级分析：,Small RNA,的分类注释,miRNA/siRNA/piRNA,的鉴定,新,miRNA,预测,差异表达,miRNA,聚类分析等,References,1,、,Eugene Berezikov,Nicolas Robine,Anastasia Samsonova,et al.Deep annotation of Drosophila me