第3章-细胞生物学研究方法-(上).ppt

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病毒的基本知识,病毒的大小差别很大，通常比细菌要小，一般在10-30nm之间。,在结构上比原核细胞和真核细胞都要简单得多，由核酸(DNA或RNA)芯和蛋白质衣壳(capsid)所构成，称核衣壳(nucleocapsid)。病毒衣壳有保护病毒核酸不受酶消化的作用。,各种病毒所含的遗传信息量不同，少的只含有3个基因，多的可达300个不同的基因。,a.烟草花叶病毒；b.腺病毒;c.流感病毒;d.,T4噬菌体,衣壳体,糖蛋白,膜质的被膜,尾鞘,HIV病毒,（人免疫缺陷病毒）,蛋白质外壳,反转录酶,脂双层,脊髓灰质炎病毒(球形),烟草花叶病毒(线形),痘病毒(砖形),T4噬菌体(蝌蚪形),狂犬病毒(子弹形),流感病毒(丝状有被膜),病毒的生活周期可分为两个阶段：,一个是细胞外阶段，以成熟的病毒粒子形式存在；,另一个是细胞内阶段，即感染阶段，在此阶段中进行复制和繁殖感染阶段开始时，病毒的遗传物质由衣壳中释放出来，注入宿主细胞中，然后在病毒核酸信息的指导控制下，形成新的病毒粒子。,4.2 病毒的复制（增殖）,衣壳装配,吸附侵入复制成熟释放 5个基本过程,4.2 病毒的复制（增殖）,流感病毒的吞入式侵入,双链DNA末端共价闭合,单链RNA,单链DNA,单链环状DNA,双链环状DNA,双链DNA末端共价连接蛋白质,根据寄生的宿主不同，病毒可分为,动物病毒、植物病毒和细菌病毒（即噬菌体）三大类。,根据病毒所含的核酸的性质和状态不同，可将病毒分为：,例 1 非典型性肺炎,（严重急性呼吸道综合症）,（,Severe acute respiratory syndrome,SARS),2003年春在我国和世界20多个国家发生了一种传染性病毒病，导致严重急性呼吸道综合征，即非典型肺炎。WHO正式确认SARS病毒是一种新型冠状病毒。目前已经发现有十几个变种。,95%感染SARS的人能够治愈。，人体可以针对病毒产生抗体，表明SARS是可治的，同时也是可控可防的。,进入细胞,出芽释放,电子显微镜观察,的患者SARS病毒,例 2 禽流感病毒,（Avian Influenza）,禽流感病毒于,1900,年发现，至,1955,年被分离成功，并被确认为甲型流感病毒。现知主要感染鸡、鸭、火鸡、水禽和候鸟等。禽流感不是我国民间所说的鸡瘟，我国民间所说的鸡瘟是另外一个烈性传染病,-,新城疫。,禽流感（,Avian Influenza,，,AI),是由禽流感病毒（,Avian Influenza Virus,，,AIV),引起的一种急性传染病。,通俗地说，就是禽类的病毒性流行性感冒，是由,A,型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病，禽类感染后死亡率很高。,例 2 禽流感病毒,（Avian Influenza）,禽流感病毒属正粘病毒科,(,Orthomyxoviridae,family)A,型，呈,球形,，有囊膜，直径,80120nm,，平均为,100nm,，基因组为单股负链,RNA,，由,8,股,RNA,节段构成，分别编码不同的蛋白。根据外膜血凝素（,HA,）抗原和神经氨酸酶（,NA,）的不同，目前可分为,15,个,H,亚型（,H1H15,）和,9,个,N,亚型（,N1N9,），任何一种,HA,与任何一种,NA,结合后即为一种血清亚型。,原先禽流感病毒中仅,H1,、,H2,、,H3,和,N1,、,N2,与人流感有关。,1997,年香港禽流感事件以及,1997,年内地和香港,H9N2,及,2003,年荷兰,H7N7,禽流感病毒感染人事件发生后，又在其中增加了新的亚型（,H5,、,H7,和,H9,。,例 2 禽流感病毒,（Avian Influenza）,第三章,细胞生物学研究方法,2009-3-5,研究方法和手段的不断创新推动着科学的发展，每当有一种新的重大技术突破时，即预示着科学将又一次飞跃，所以研究方法是非常重要的。,当今细胞生物学中使用的方法多种多样，但总地来说，可划分为四大类：细胞形态观察的方法（显微技术）、细胞组分分析与原位检测技术、细胞培养与细胞工程技术和分子生物学技术等。,为什么学习研究方法？,学习要求：,1.细胞生物学是一门实践很强的科学，通过本章的学习和实验课的操作实践，应了解掌握：普通光学显微镜、常用特殊光学显微镜和电子显微镜的使用方法及其基本原理；细胞结构及细胞组分的分离分析方法；常用组织细胞化学的原理及操作技术；细胞培养和细胞工程的基本操作技术；常用的模式生物。,2.了解特殊电镜及相关的技术和方法、荧光标记技术、放射自显影技术、流式细胞术和显微操作的基本方法。,细胞生物学研究方法,进行初步观察,形成可验证的假说,设计对照试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已,有知识,生物学研究模式生物,不同物种享有共同分子机制,遗传学方法是细胞生物学功能研究的最有效和可靠的方法,生物信息学的发展为细胞生物学的研究提供了重要的研究线索,功能基因组学和蛋白质组学将成为新的研究趋势,动态的和活体的观察是细胞生物学研究的重要趋势,大量的、先进的物理学和化学方法和技术为细胞生物学研究开辟了新的研究领域和途径,细胞生物学研究方法,第一节：常用模式生物,第二节：细胞形态结构的观察方法,第三节：组分分析第四节：细胞培养、细胞功能,生物学研究的模式生物,不同的物种享有共同的分子机制,第二节,细胞形态结构的观察方法,2.1光学和电子显微镜的成像原理,无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统.,在光学显微镜中,照明系统是可见光,使用的是玻璃透镜,可直接通过目镜观察镜像.在电子显微镜中,照明系统为电子束,是用电磁透镜通过荧光屏观察样品的镜像.,尽管这两类显微镜的照明系统和装置的设计不同,但是他们所依据的原理相同,成像方式相似.当样品被放置在光或电子束的通路中,光束或电子束被改变的物理特征能够用肉眼观察或被显像板记录下来.,光学显微镜与电子显微镜,2.2 光学显微技术,（一）显微镜的分辨率,影响显微镜成象清晰度最关键的问题是显微镜的,分辩率（resolution）。分辩率是指显微镜将物体,放大成像后（或人眼在25厘米的明视距离处）能将,物体相近两点分辩清楚的距离极限，这个距离越,近，则分辩本领越高。,放大率：最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。总放大率=物镜放大率,目镜放大率，放大率受分辨率的限制。,（一）显微镜的分辨率,一般来说，光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍，由于透镜的数值孔径范围是1.0-1.4，所以光学显微镜再用空气作介质时最大放大倍数为1000倍，油镜则为1400倍。,要提高光学显微镜的分辨率，需采取两个措施：增大角孔径或缩短波长。如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波，分辨率就可以大大提高。电子显微镜就是在这种需求下发明的。,罗伯特虎克制造的显微镜（,1665）,放大倍数：140倍,列文虎克和他的显微镜（约1680）,2.3 光学显微镜技术,1。普通复式光学显微镜技术,2。相差和微分干涉显微镜技术,3。荧光显微镜技术,4。激光扫描共焦显微镜技术,5。荧光共振能量转移技术,6。荧光漂白恢复技术,普通复式光学显微镜,普通光学显微镜,用于细胞一般形态结构的观察，可看到细胞核、核仁、细胞膜、线粒体、中心体、高尔基体、染色体等。是应用最广泛的显微镜。,光镜主要由三部分组成,（1）光学放大系统为两组玻璃透镜：目镜与物镜,（2）照明系统：包括光源、折光镜和聚光镜,（3）机械和支架系统主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控。,正置显微镜和倒置显微镜,尼康Eclipse TE2000倒置显微镜,生物样品一般不能直接在普通光镜下观察，必须经过,固定、包埋、切片和染色处理,以后才能观察到其显微结构。,固定,是把生物组织用化学试剂浸泡，常用的固定剂有甲醛、甲醇、戊二醛和乙醇、冰醋酸等。固定剂可将生物大分子交联，蛋白质等各种成分迅速地凝固。为了使样品切成薄片，切片前样品需用包埋介质进行,包埋,，常用的包埋介质有石蜡等。细胞内的各种组分对可见光的吸收程度差别很小，所以,切片,在观察前应先染色。染色液,含有发色集团的有机化合物，当染色液具有助色团成为盐类物质，即可溶解于水并具有电荷，与组织有亲和力，从而使组织着色，并在不同的结构呈现不同的染色。常用的染色液有苏木精和伊红（HE）、碱性品红等。,光镜样品的制备,包埋的样品,玻璃或金属刀片,超薄切片条,将切片条置于玻片上，染色、加盖玻片,切片机的臂,相差显微镜,普通光学显微镜能观察染色的生物标本，主要是因为光线通过染色标本时其波长和振幅发生变化，人的眼睛才能观察到。而活细胞和未经染色的生物标本，当光线通过它时，光的波长和振幅变化不大，所以用普通光学显微镜无法观察到。另外还有人眼无法分辨的相位的差异，只有当将相位差转变成振幅差时，才能被人们分辨出来。相差显微镜就是通过在普通光镜的聚光器上加一个环形光阑，在物镜的后焦面加一个相板制成。其原理是通过改变光线的振幅差，提高细胞结构的对比度而提高分辨力。使活细胞的标本内各种结构出现清晰的反差而被观察到。,微分干涉显微镜,用平面偏振光经棱镜折射后分成两束，于不同时间经过样品的相邻部位，此后又经过另一个棱镜将两束光汇合。由此样品厚度的微小区别就成为明暗差异，增强了样品的反差并具立体感，适于研究活细胞中较大颗粒或细胞器。,培养物中未经染色的的同一个动物细胞的三个图象。A.普通光学显微镜亮视野看到的。B.微分干涉显微镜。C.相差显微镜系统。,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。,即：物质吸收短波光，发射出的长波光。,3.荧光显微镜术,荧光的种类,自发荧光 二次荧光,自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光,二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光,荧光的性质,吸收光,保持固有的荧光特性,荧光波长激发波长,荧光强度极小于激发光的强度,有不同程度的衰减,荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光显微镜,荧光显微镜的主要部件,透射式,汞灯光源,激发滤色镜,暗场聚光镜,吸收滤色镜,落射式,汞灯光源,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,透射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯箱,落射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜激发滤色镜,分色镜,汞灯,紫外线保护罩,孔径光栏,（FS）,视场光栏,（AS）,滤色镜的选择,荧光素的特性,滤色镜的特性,激发,分色,吸收,根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜,激发滤色镜的选择,激发滤色镜,吸收滤色镜,FITC,吸收,FITC,发射,分色镜,-激发滤色镜的带宽应尽量符合荧光色素的特性,双重染色标本的单色和双色观察,NUA,WIB,DUAL,BAND(,特制）,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,-选用单色和双色滤色镜,油菜,小黑麦,甘薯,玉米,棉花,4.激光共聚焦扫描显微镜,激光共聚焦扫描显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型的显微镜。它是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色光作为光源，使样品被激发出荧光。共聚焦是指物镜和聚光镜同时聚焦到一个点上，也就是物镜和聚光镜相互共焦点。其优点是实现了点照明，使光线聚在附设仪器的小孔光阑中，保证只使来自聚焦点的光成像，,排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率,再加上图像信息的计算机重建处理，能使观察的标本图像更加清晰,，可重构样品的三维结构。,基本概念：,1.分辨率resoving power,：指人眼或显微镜在25cm明视距离处，能分辨被检物体细微结构最小距离的能力，其单位为长度单位，常用的有毫米、微米、纳米等。,2.冰冻蚀刻freeze etching电子显微镜技术：,是为配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。其原理及过程是用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂。这时，样品往往从其结构相对脆弱的部位（膜脂双分子层的疏水端）断裂，从而显示出镶嵌在膜脂中蛋白质颗粒。由于冰在真空中少量升华，可进一步增强浮雕式的蚀刻效果。用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，在经碳垂直于断面进行真空喷镀形成一个连续的碳膜，然后，用消化液把赝品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上用电镜进行观察。冰冻蚀刻技术主要用于观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，图形富有立体感，样品不需包埋甚至也不需固定，同时能更好地保持样品的真实结构。它是研究生物膜内部结构的一种有用技术。,3.细胞化学法：,是一类经典的细胞生物学实验方法，其特点是不依赖经验染色技术，而是基于已有的化学反应，在细胞原位上显示出细胞的化学成分以及在不同条件下的形态、成分和功能的综合变化，将结构和机能更紧密地联系在一起。为了能在完好的结构上同时显示其化学物质，细胞化学技术必须满足下列要求：,保持细胞在生活状态下的结构；保持细胞内的生前化学成分及酶活性；进行的方法是已知的化学反应；具有高度特异性；反应产物是一种有色物质，能形成稳定的沉淀，定位精确，或者电子密度高以供电子显微镜观察用。,4.显微放射自显影microautoradiography,：是将放射性分子引入机体或细胞,使其渗入生物大分子,或结合于一定部位.在利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用显示样品中放射物质的所在.由此指示某种生物大分子质合成及部位,或特定物质的定位.,5.电子显微镜三维重构技术:,是电子显微术电子衍射与计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术.尤其适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质核酸复合物等大的复合体的三维结构.其基本步骤是对生物样品在电镜中不同倾角下进行拍照,得到一系列电子显微镜图片后在经傅立叶变换等处理,从而展现出大分子及其复合物三维结构的电子密度图.,6.密度梯度离心 density gradient centrifugation是细胞组分通过某些梯度密度溶液离心使得各个成分互相分开的技术.操作时应将要分离细胞组分小心地铺在含有密度不断增加的、形成密度梯度的高溶解性的惰性物质（如蔗糖）溶液的表面。在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉淀带，而使不同的组分得以分离。,7.差速离心differential centrifugation:,是利用不同速度离心所产生的不同离心力将各亚细胞组分或各种颗粒分次沉淀的分离技术。,8.荧光原位杂交 fluorescent in situ hybridization,FISH：,是在细胞保持基本形态的情况下将荧光探针注入细胞内与DNA或RNA杂交，通过观察荧光标记物的杂交位置来定位染色体或其他结构的标记技术。根据所用探针种类和要检测核酸的不同可分为DNA-DNA、RNA DNA、RNA-RNA杂交。无论哪一种杂交，其基本程序都是适当处理是细胞通透性增加，探针进入细胞内与DNA或RNA杂交、洗脱等步骤。,9.细胞株cell strain和细胞系cell line:,原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可渡过危机而存活下去。这些存活的细胞一般可顺利地传4050代次，并且仍然保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。很多学者把这种传代细胞称为细胞株。一般情况下，当细胞株传至50代后又要出现危机，不能再传下去。但如有部分细胞发生了遗传突变，产生癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为细胞系。细胞系细胞的根本特点是染色体明显改变，一般呈现亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制的细胞容易传代培养。,10.原代细胞培养：,是指直接从有机体中取得细胞或组织后立即进行的培养，严格的说是指成功继代之前的培养，此时细胞保持原有的基本性质，通常把第一代到第十代以内的培养细胞统称为元代细胞培养。,11.核酸的杂交：,通过互补的DNA或RNA探针与研究的DNA或RNA之间进行碱基配对，分离或鉴定特异的核酸片断。也可用于比较两个核酸之间的相似性。,问答题：,1.简述细胞生物学的主要研究方法？,代表细胞生物学传统和发展方向的研究方法，可以分为四大方面。（1）显微技术，这是进行细胞形态结构观察的方法，包括光学显微术、电子显微术和扫描隧道显微术等，目前的分辨本领已达到0.1nm的水平，可以直接观察到DNA、RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构。（2）细胞组分的分析与原为检测技术，这类方法可对亚细胞结构和生物大分子进行分离和纯化，并可在细胞的原位上检测亚细胞结构和某些大分子的存在状况；（3）细胞培养和细胞工程技术，这是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究和生物工程中重要的实验技术，具有广泛的、重要的理论意义和实践价值；（4）分子生物学技术，如核酸和蛋白成分的分析和序列测定；核酸的杂交、PCR、基因的克隆与表达以及基因的剔除、RNA干扰技术等，这些都是当今细胞生物学研究中常常使用的实验方法。而且一些物理、化学和信息处理技术也正在被用于细胞生物学的研究。现代细胞生物学的方法及其多样和处于不断的发展当中。,2.简述动物转基因技术的过程。,转基因动物技术是一项复杂而且涉及内容广泛的技术，其制作过程如下：,（1）克隆目的基因；（2）给目的基因接上适当的启动子元件；（3）外源基因的导入，即利用显微操作或其他方法将外源基因注射到动物早期胚胎中，再把胚胎植入动物子宫内；（4）外源基因整合与表达的检测。转入基因一般是随机整合到宿主动物基因组，但并非所有的外源基因都能整合到动物基因组，而整合的基因也并非都能表达。因此需要对转基因动物进行严格的检测和筛选。在转基因动物制作中，基因转移是影响外源基因整合效率的关键步骤，也是技术难度最大的步骤。,3.在进行细胞组分的分离时，实验方案设计的一般原则是什么？,根据不同的细胞器或分子具有不同的体积与密度，通过离心力场的作用加以分离。根据这两个主要因素可设计不同的离心方法：速度离心、等密度离心等。,从下列17种方法中挑选一种最佳方法来探测下面的7个问题。,a.电子显微镜三维成像与X射线衍射及核磁共振技术；b.southern 杂交；c.扫描电镜技术；d.细胞显微分光光度法；e.免疫荧光技术；f.电子显微镜技术；g.Northern杂交；h.放射自显影技术；I.超离心技术；j.原位杂交技术；k.单克隆抗体技术；m.细胞融合技术；n.流式细胞术；o.免疫电子显微镜技术；p.冷冻蚀刻技术；q.细胞培养技术；r.显微操作技术。,问题：1.高等动物克隆的制作（）。2.某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的DNA复制还是阻止蛋白质合成()。3.研究细胞膜种蛋白质分布情况（）。4.已克隆了人的rDNA，问rDNA分布在人的那几条染色体上（）。5.体外细胞培养，从G1期到S期，细胞表面形态结构的变化（）。6.原代培养细胞长成致密蛋层，由于接触抑制作用DNA合成停止，如何证明（）。7.研究酵母菌在无氧和有氧条件下生长时，其线粒体形态结构的变化（）。,思考题：,根据你目前所掌握的知识，在生命科学领域里提出一个你认为是很有意义的问题，并设计出解决该问题的方法。,