核酸的化学3学分.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1868,年，瑞士,Miescher,发现核酸,。,1889,年，,Altmann,提出,核酸,概念。,1953,年，,Watson,和,Crick,提出,DNA,双螺旋结构模型,，是,20,世纪自然科学最伟大成就之一。,1958,年，,Crick,提出遗传信息传递的,中心法则,，并于,1971,年修改了该法则,。,1961,年，,Jacob,和,Monod,提出,操纵子学说,1966,年，,Nirenberg,等破译出,遗传密码,1981,年，,Cech,发现,核酶,（,Ribozyme,）,1983,年Simons,等发现,反义,RNA,20,世纪,70,年代，诞生,DNA,重组技术,。并诞生基因工程。,20,世纪,90,年代开始实施,人类基因组计划,，开始进行基因组学研究。生物技术产业空前发展。,核,酸,的,研,究,历,程,20,世纪,40,年代末，,Avery,的“肺炎双球菌转化”实验证明,DNA,是有机体的遗传物质：,DNA,无荚膜，不致病,温育,有荚膜，致病,传代,传代,有荚膜，致病,有荚膜，致病,有荚膜，致病,一、,核酸的种类、分布、功能,种类,脱氧核糖核酸（,DNA,）：,是主要的遗传物质。,核糖核酸（,RNA,）,tRNA,(15%),mRNA,(3-5%),rRNA,(80%),其它,RNA,：,如反义,RNA,等,所有生物细胞都含有,DNA,和,RNA,这两类核酸，而病毒只含,DNA,或,RNA,。,二、核酸的组成成分,p478,核酸,nucleic acid,核苷酸,nucleotide,核苷,nucleoside,磷酸,phosphate,嘌呤碱,purine base,嘧啶碱,pyrimidine base,（碱基,base,）,核糖,ribose,(,或,脱氧核糖,deoxyribose),（戊糖,amyl sugar,）,核酸是由核苷酸组成，含磷较多，酸性较强的高分子化合物。,（一）核糖和脱氧核糖,O,HOH,2,C,OH,O,H,OH,1,2,OHOH,2,C,OH,OH,1,2,-D-2-,核糖,-D-2-,脱氧核糖,O,核糖,+H,+,糠醛,甲基间苯二酚,(,地衣酚,),FeCl,3,绿色产物,脱氧核糖,+H,+,-,羟基,-,酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA,和,DNA,定性、定量测定,（二）嘌呤碱和嘧啶碱,N,N,N,N,H,H,H,H,N,N,N,N,H,H,H,H,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,Pu,NH,2,腺嘌呤,adenine,（,A,）,N,N,N,N,H,H,H,H,O,H,2,N,鸟嘌呤,guanine,（,G,）,N,N,H,H,H,H,嘧啶,Py,1,2,3,4,5,6,N,N,H,H,H,HNH,2,O,H,胞嘧啶,Cytosine,（,C,）,N,N,H,H,H,H,O,O,H,H,尿嘧啶,uracil,（,U,）,N,N,H,H,H,H,O,O,H,H,CH,3,胸腺嘧啶,thymine,（,T,）,N,N,O,O,H,H,H,酮式,H,N,N,O,O,H,H,H,酮式,H,H,H,烯醇式,（三）核苷,O,HOH,2,C,OH,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,N,N,N,H,NH2,H,H,9,腺嘌呤,腺苷,O,HOH,2,C,OH,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,O,HOH,2,C,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,N,O,O,H,H,H,尿嘧啶,H,1,尿苷,N,C,O,O,NH,H,H,5,1,OH,假尿苷（,）,（四）核苷酸,O,HOH,2,C,OH,OH,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,N,N,N,H,NH2,H,H,9,腺嘌呤,胸 苷,P,O,-,-,O,O,胸苷,-5-,磷酸,AMP,O,P,O,-,-,O,O,ADP,ATP,P,O,-,-,O,O,各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成,RNA,和,DNA,合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用,：,ATP,能量“货币”,UTP,参加糖的互相转化与合成,CTP,参加磷脂的合成,GTP,参加蛋白质和嘌呤的合成,第二信使,cAMP,H,O,-,O,O,CH,2T,O=P,O,-,3,5,OH,H,O,-,O,OCH,2,G,O=P,O,-,3,5,OH,O,OCH,2,OH,H,A,O=P,O,O,-,3,5,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpA,OH,pG-T-A,pGTA,脱氧核苷酸的序列常被认为是,碱基序列,（,base sequence),。,通常碱基序列由,DNA,链,53,方向写。,（一）,DNA,的一级结构,三、,DNA,的结构,DNA,的四级结构,一级结构：,由多个脱氧核苷酸分子通过,3,，,5,磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。,二级结构：,在碱基互补配对的基础上形成的,DNA,双螺旋结构,。,三级结构：在二级结构上，,DNA,双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特定构象。如超螺旋等。,四级结构：,指,DNA,与蛋白质形成的复合物。如,染色体,（质）。,1.,双螺旋结构的主要依据,（,1,）,Wilkins,和,Franklin,发现不同来源的,DNA,纤维具有相似的,X,射线衍射,图谱,。,（,2,）,Chargaff,规则,在双链,DNA,分子中，碱基摩尔数存在下列关系：,A=T G=C A+C=G+T A+G=T+C,（,3,）,电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。,后,Pauling,和,Corey,发现,A,与,T,生成,2,个氢键、,C,与,G,生成,3,个氢键。,2.,双螺旋,结构模型要点,p486,（,1,）,主链,：,两条多核苷酸链反向平行。,两条链均为右手螺旋。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行；,（,2,）,碱基：,碱基位于内侧，碱基互补配对，,A,与,T,、,G,与,C,配对。,（,3,）,螺距,：双螺旋每转一周有,10,个,bp,，螺距,3.4nm,，直径,2nm,。,(4),大沟和,小沟,（二）,DNA,的双螺旋结构,1953,年，,Watson,和,Crick,提出。,3.,双螺旋结构的稳定因素,（,1,）,氢键,（太弱）；（,2,）,碱基堆积力,（,base stacking force,，由芳香族碱基,电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定,DNA,最重要的因素；（,3,）,离子键,（减少双链间的静电斥力）。,4.DNA,双螺旋的构象类型,B-DNA,：,92%,相对湿度，,钠盐,；接近细胞内的,DNA,构象，与,Watson,和,Crick,提出的模型相似。,5.,碱基在一条链上的排列顺序不受限制，但一旦确定后，即可,决定另一条互补链上的序列。,C-DNA,：,4446%,相对湿度。可能是特定条件下,B-DNA,和,A-DNA,的转化中间物。,D-DNA,：,60%,相对湿度。,E-DNA,（三）,DNA,的三级结构,线形分子、双链环状,(dcDNA),超螺旋、,染色体包装,A-DNA,：,75%,相对湿度，与溶液中,DNA-RNA,杂交分子的构象相似。,Z-DNA,：主链呈锯齿型,左向盘绕,。,B-DNA,与,Z-DNA,的相互转换可能和基因的调控有关。,p489,再次扭曲、螺旋,（四）,染色体包装的结构模型,多级螺旋模型,压缩倍数,7 6 40 5,（,8400,）,DNA ,核小体 螺线管 超螺线管 染色单体,2nm 10nm 30nm 400nm 210m,一级包装 二级包装 三级包装 四级包装,四、,DNA,与基因组织,DNA,Transcription,RNA,（,mRNA,、,tRNA,、,rRNA,）,Translation,Protein,基因,基因,是指具有遗传效应的,DNA,片段或,RNA,，它能编码蛋白质或功能,RNA,。某些病毒的基因组是,RNA,。,结构基因,调节基因,基因组,（一）,DNA,与基因,（二）原核生物基因组的特点,1.DNA,大部分为结构基因，每个基因出现频率低。,2.,功能相关基因串联在一起，并转录在同一,mRNA,中（多顺反子）。,3.,有基因重叠现象。,A,B,C,D,E,F,G,（三）真核生物基因组的特点,1.,重复序列,单拷贝序列,：,在整个,DNA,中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。,中度重复序列,：在,DNA,中可重复几十次到几千次,。,高度重复序列,：,可重复几百万次,高度重复序列一般富含,A-T,或,G-C,，富含,A-T,的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体,DNA,更靠近管口；富含,G-C,的更靠近管底，称为,卫星,DNA,（,satellite DNA,）,富含,A-T,富含,G-C,主体,DNA,2.,有断裂基因,mRNA,1 872bp,内含子（,intron),：基因中不为多肽编码，不在,mRNA,中出现。,A,B,C,D,E,G,7 700bp,F,外显子（,exons,）：为多肽编码的基因片段。,：由于基因中内含子的存在。,例外,：组蛋白基因,(histongene),和干扰素基因,(interferon gene),没有内含子。,transcription,四、,RNA,的结构与功能,RNA,分子高级结构是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链,。,（一）,tRNA,tRNA,约占,RNA,总量的,15%,，主要作用是转运氨基酸用于合成蛋白质。,tRNA,分子量为,4S,，,1965,年,Holley,测定酵母,t,RNA,Ala,一级结构，提出,三叶草,二级结构模型。,倒,L,型,三级结构,主要特征,：,1.,四臂四环；,2.,氨基酸臂,3,端有,CCA,OH,的共有结构；,3.D,环上有二氢尿嘧啶（,D,）；,4.,反密码环上的反密码子与,mRNA,相互作用；,5.,可变环上的核苷酸数目可以变动；,6.T,C,环含有,T,和,；,7.,含有修饰碱基和不变核苷酸。,RNA,二级结构的通式：发夹结构或茎环结构,（二）,rRNA,占细胞,RNA,总量的,80%,，与蛋白质（,40%,）共同组成核糖体。,原 核 生 物,真 核 生 物,核糖体,rRNA,核糖体,rRNA,70S,（,30S,、,50S,）,16S,、,5S,、,23S,80S,（,40S,、,60S,）,18S,、,5S,、,5.8S,、,28S,90,年代初，,Noller,证明,23SrRNA,具肽酰转移酶活性，蛋白质只是维持,rRNA,的构象。,（三）,mRNA,与,hnRNA,mRNA,约占细胞,RNA,总量的,35%,，是蛋白质合成的模板。,真核生物,mRNA,的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的,hnRNA,。,真核生物,mRNA,特点,：,5,端有帽子结构；,3,端加,poly A,尾,（四）,snRNA,和,asRNA,snRNA,主要存于细胞核中，占细胞,RNA,总量的,0.11%,，与蛋白质以,RNP,（核糖核酸蛋白）的形式存在，在,hnRNA,和,rRNA,的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。,asRNA,可通过互补序列与特定的,mRNA,结合，抑制,mRNA,的翻译，还可抑制,DNA,的复制和转录。,五、核酸的性质,p503,（一）一般理化性质,1.,为两性电解质，通常表现为酸性。2.DNA,为白色纤维状固体，,RNA,为白色粉末,3.DNA,溶液的粘度极高，而,RNA,溶液要小得多。,5.RNA,能在室温条件下被稀碱,水解,而,DNA,对碱稳定。,6.,利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定,DNA,与,RNA,。,（二）核酸的紫外吸收性质,p507,核酸,的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在,260nm,（,蛋白质,的紫外吸收峰在,280nm,）。,4.,都溶于水不溶于有机溶剂如乙醇。,分离,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少,3040%,，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（,增色效应,），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（,减色效应,）,。当,A,1,时，,DNA,：,50ug/ml,，,RNA,和单链,DNA,：,40ug/ml,，,寡核苷酸：,20ug/ml,。,纯,DNA,，,A,260,/A,280,=1.8,=2.0,。,若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则,A,260,/A,280,比值明显降低。,1.8,，,DNA,很纯；,=2 RNA,很纯,用,A260/A280,还可来表示,核酸的纯度：,核酸含量测定,（三）核酸的变性,：,双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，变成单链，并不涉及共价键的断裂。,DNA,变性是个突变过程。,将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称,熔解温度,(melting temperature,Tm),。,T,m,T,m,DNA,的双螺旋结构失去一半时对应的温度,热变性,因素 酸碱变性（,pH,小于,4,或大于,11,，碱基间氢键全部断裂）,变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）,变性后 粘度降低，紫外吸收增加。,二级结构改变，部分失活。,影响,Tm,的因素,：,（,1,）,G-C,的相对含量,（,G+C,）,%=,（,Tm 69.3,）,2.44,（,2,）,介质离子强度低，,Tm,低。,（,3,）,DNA,均一性,均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围,（五）核酸的复性（退火）,：,变性核酸的两条互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。,影响复性速度的因素,：,（,1,）单链片段浓度,（,2,）单链片段的大小,（,3,）溶液离子强度的大小,（越高越容易）,（,4,）溶液温度的高低,复性速度可用,C,o,t,1/2,衡量,（六）分子杂交,p510,：,在退火条件下，不同来源的,DNA,互补形成双链，或,DNA,单链和,RNA,链的互补形成,DNA-RNA,杂合双链的过程。,探针,：,一段与待测,DNA,或,RNA,互补的核苷酸序列，用放射性同位素或荧光等标记。,原位,杂交技术,：,直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。,Southern,印迹法,：,将电泳分离后的,DNA,片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern,印迹法,：,将电泳分离后的,RNA,吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,六、核酸的序列测定,p518,目前多采用,Sanger,的酶法和,Maxam-Gilbert,的化学法,O,HOH,2,C,H,H,OH,1,2,3,4,5,核 糖,N,N,N,N,H,H,H,H,9,腺嘌呤,ddATP,P,P,P,原理：基本反应也是利用,DNA,聚合酶的酶促反应。,反应体系包括模板,DNA,、,引物、,4,种核苷酸和,DNA,聚,合酶外，还加入一定比例的,ddNTP,，它随机的掺入合,成的,DNA,链，一旦掺入,DNA,合成终止，得到以,ddNTP,为结尾的不同大小片段。,通过电泳直接读出,DNA,序列。,小沟,大沟,主要特征,：,1.,四臂四环；,2.,氨基酸臂,3,端,CCA,OH,的共有结构；,3.D,环上有二氢尿嘧啶（,D,）；,4.,反密码环上的反密码子与,mRNA,相互作用；,5.,可变环上的核苷酸数目可以变动；,6.T,C,环含有,T,和,；,7.,含有修饰碱基和不变核苷酸。,CCGGTAGCAATT,3,5,模板,引物,GG,5,3,GG,C,GGC,C,GGCCAT,C,C,ddCTP,GGCC,A,GGCCATCGTTG,A,ddATP,A,GGCCATC,G,GGCCATCGTT,G,G,ddGTP,GGCCA,T,GGCCATCG,T,GGCCATCGT,T,T,ddTTP,C,C,A,TC,G,T,T,G,A,5,3,1989,年，第一种基因药物,重组,lb,干扰素,获准投放市场。至,1999,年，我国已有,18,种基因药物和疫苗获准进行商业化生产，另有,26,种基因药物处于临床前或临床,、,期试验，生物医药产业已初具规模。,1990,年我国研制了第一例转基因家畜，,1991,年山羊克隆获得成功。,1993,年我国第一例转基因作物,抗病毒烟草,进入了大田试验。,1997,年第一例转基因,耐储存番茄,获准进行商品化生产，至,1999,年共有,6,种转基因作物产品投放市场。,2000,年我国转基因,抗虫棉花,种植面积超过,550,万亩。,我国是,人类基因组计划,国际大协作的成员国，承担完成,1%,的任务。美、英、日、法、德、中科学家于,2000,年,6,月,26,日宣布人类基因组全部,DNA,序列的工作框架图已经完成。,我国在国际上首先发现,神经性耳聋的基因,，基因治疗已有,4,个项目进入临床试验阶段。,生物芯片技术,的开发研究与产业化正在与国际同步发展。,染色体多级螺旋模型,核酸水解,p502,酸水解,：,糖苷键比磷酸酯键易水解，嘌呤比嘧啶糖苷键易断裂。,（最易是,DNA,的嘌呤糖苷键）,碱水解,：,RNA,易被碱水解,（,室温，,0.1mol/LNaOH,可将,RNA,完全水解，得到,2,-,或,3,-,磷酸核苷的混合物,）；,DNA,耐碱,酶水解,生物体内存在多种核酸水解酶,RNA,水解酶,RNase,DNA,水解酶,DNase,核酸外切酶,从末端逐个切下核苷酸,核酸内切酶,：,专一性水解某一特定核甘酸所形成的磷酸二酯键,最重要的：限制性核酸内切酶,水解某一特定碱基序列,回文结构,核酸含量测定,p514-516,一）紫外吸收法,二）定磷法：,9.5%,三）定糖法：,地衣酚,二苯胺,核酸纯度测定,最简单方法：,紫外吸收法,DNA,的凝胶电泳,按分子大小来分离,溴化乙锭,EB,荧光染色,DNA,的分离,p513,DNP,溶于浓盐溶液,1N NaCl,，但不溶于稀盐溶液,0.14N NaCl,浓盐溶液提取 稀盐溶液沉淀 苯酚抽提 乙醇沉淀,RNP,溶于稀盐溶液,0.14N NaCl,RNase,到处存在,抽提要加酸性胍盐,/,苯酚,/,氯仿,/RNase,抑制剂,/,高温（器皿）,Southern Blotting,未知的,DNA-DNA,限制性内切酶,DNA,片段,-,琼脂糖电泳分离,-,碱液变性,-,影印在硝酸纤维薄膜上,与放射性标记的已知,DNA,单链或,RNA,杂交,-,放射自显影,“,钓基因,”,（,a,）,（,b,）,（,c,）,（,d,）,（,e,）,基因组,DNA,DNA,限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因,DNA,片段,X,光底片,Southern Blotting,未知的,DNA-DNA,限制性内切酶,DNA,片段,-,琼脂糖电泳分离,-,碱液变性,-,影印在硝酸纤维薄膜上,-,与放射性标记的已知,DNA,单链或,RNA,杂交,-,放射自显影,“,钓基因,”,hnRNA(heterogeneous nuclear RNA)-,核不均一,RNA,snRNA(small nuclear RNA),核内小,RNA,scRNA(small cytoplasmic RNA),胞质小,RNA,asRNA(antisense RNA),反义,RNA,cccDNA(covalently closed circular DNA),共价闭环,DNA,ocDNA(open circular DNA),开环,DNA,linear DNA,线形,DNA,dsDNA(double-strand DNA),双链,DNA,ssDNA(sigle-strand DNA),单链,DNA,记忆口诀：,先将嘌呤和嘧啶的结构式记住，然后再记住下面口诀,胸,前一滩尿：,U+,一碳基团（甲基）,T,尿,里两泡泡：嘧啶中有两个,O,U,上面一个是氨气,包,：,U,靠上面的一个,O,换成,-NH2,=,C,鸟,儿张嘴吸氨气：张嘴即,O,，嘌呤有,O,又有,-NH2,G,线,儿将鸟嘴来系，注意换气（氨气）：系嘴即去掉,O,，,G,去掉,O,再把,-NH2,换个位置 ,A,菌落原位杂交,