中药化学第二章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,（一）糖类：,多羟基的醛或酮。,1.单糖：通式为（,CH,2,O）n,的多羟基的醛或酮,n38。,单糖为糖类化合物可水解的最小单位。植物药中存在较多的为己糖或戊糖。,2低聚糖（寡糖）,：,由29个单糖经苷键聚合 而成。如：,3多糖：由10个以上的单糖组成，其聚合度可达数千。,植物常见的多糖有淀粉、纤维素、树胶、粘液质（粘胶质），一般难溶于冷水，溶于热水呈胶体溶液或悬浮液（具羧基的酸性多糖可溶于碱水），不溶于乙醇、丙酮及其它有机溶剂。,一般作为无效成分除去，并尽量避免提出，以免堵塞滤孔。少数多糖有效，如香菇多糖（抗癌）、黄芪多糖（提高免疫力）。,（二）氨基酸、蛋白质及酶,1.,氨基酸：既有氨基又有羧基的化合物，多为无色结晶，具酸碱两性，溶于水和稀乙醇（30左右），难溶于其它有机溶剂。,氨基酸除具营养价值外多作无效成分除去。,近年来中药中也发现,少数有,生物活性的氨基酸,。如：,2.蛋白质和酶,蛋白质：由氨基酸（,氨基酸）经肽链相连而成（分子量多在5.010,3,1.010,7,），溶于水成胶体溶液，多难溶于有机溶剂，遇强热、酸、碱、重金属盐产生变性沉淀。,可引起人体异性蛋白反应（注射剂中），一般作无效成分除去，但,近年来发现少数有药用活性的蛋白质如,天花粉蛋白（中期引产），水蛭素（抗凝血作用）等。酶：为具有高度特异性催化作用的蛋白质（又称生物催化剂），溶于水，遇强酸、碱、热等变性失去酶活性。,酶常与相应的苷处同一植物的不同细胞内，当细胞壁破裂后，酶在一定湿度及温度条件下即酶解相应的苷。因此提苷时要杀酶活性（杀酶），避免酶解有效成分，提苷元或次级苷则要保酶活性。,（三）有机酸,具羧基的有机化合物，酸性，以盐（,Na,、Ca,、Mg,）,的形式分布于植物体内，低级的有机酸溶于水及乙醇，难溶亲脂性有机溶剂。高级脂肪酸及芳香酸溶于有机溶剂，难溶于水。有机酸盐溶于水和乙醇，难溶于亲脂性有机溶剂。有机酸可与,Ca(OH),2,、,Ba(OH),2,、,Pb(Ac),2,、,Pb(OH)Ac,形成水不溶性沉淀。,中药常见的有苹果酸、草酸、酒石酸、柠檬酸等，少数有机酸具生理活性。如：,（四）油脂和蜡,油脂：多为高级脂肪酸与丙三醇形成的酯，少数也有与多元醇形成的酯。常温多为液体。不溶于水，可溶于热乙醇、丙酮，溶于乙醚、氯仿、苯、石油醚等。相对密度多 K,B,）,上例中,K,A,/K,B,10/0.1,100,100,仅作一次简单萃取就可实现基本分离,100,10,则须萃取1012次,2,时 100次以上萃取才能基本分离,1,时 则,K,A,K,B,，,无法实现分离,（2）利用酸碱性及其强弱的差异分离：,利用混合物中非解离型（游离）酸或碱常溶于亲脂性有机溶剂，而其解离型（盐）溶于水的差异分离注意,：,pH,梯度萃取法的,pH,值必须由低到高,，或者,由高到低梯度进行。,分配比与,pH,值,酸性、碱性及两性化合物的分配比还受溶剂系统的影响。因为,pH,变化可以改变它们的存在状态（非解离型或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。,酸性物质（,HA），,其在水中的解离平衡及解离常数,K，,可用下式表示：,两边取负对数,K,a,及,pKa,表示酸性物质的酸性强弱。酸性越强，,K,a,越大，,pKa,值越小。若使该酸性物质完全解离，,即使,HA,均变成,A,-,，,则,故：,若使该酸完全游离，即使,A,-,均转变成,HA,，,则：,酚类化合物的,pKa,值一般为9.210.8，羧酸类化合物的,pKa,值约为5,pH,12,大部分酸性物质以解离形式（,A,-,）,存在，溶于水,pKa=-log,同理,碱性物质（,B）,的碱性强弱用,Kb,或,pKb,表示:,碱性物质的碱性强弱更多以其共轭酸（,BH+）,的解离常数,Ka,-,或,pKa,-,值表示.,碱性越强,则其共轭酸的,Ka,值越小,pKa,值越大,pH12,则酸性物质呈解离状态（,A,），,碱性物质则呈非解 离状态（,B,）,存在,。,2、方法,（1）萃取法,、简单萃取法,多用分液漏斗或下口瓶进行，用有机相（苯，,CHCl,3,，,乙醚，,EtOAC,）,从水中萃取亲脂性成分或用水相从有机相中萃取亲脂性成分的盐：,例：茜草根总蒽醌提取物的分离,大黄酸 大黄素 大黄酚,简单萃取分离是最常用的方法，缺点是易产生乳化，因此要注意几点：,（1）先取小样试，选择不易乳化的两相溶剂后，再放大，或用,PC,摸索条件,。,（2）水提液相对密度最好是,1.11.2,，过稀浪费溶剂，体积大，浓萃取效果反而不好,。,（3）移动相少量多次进行（,1/3量左右）,。避免猛烈振摇。一般萃 取,34,次进行即可。,（4）必要时可改变萃取液的极性。如用苯提亲脂性强的成分，再用正丁醇提出亲水性强的成分。,若出现乳化可用下法破乳化,（1）加大一相的比例，若此法不成功，可将乳化层分出再 试用下法：,（2）加入,NaCl,等电解质进行盐析。,（3离心（利用溶剂相对密度差异分层）或减压过滤。,（4）加热破坏其稳定性，或冷冻（降低两相溶解度）,（5）调,pH,（6）长时间放置,。,连续萃取法,是分液漏斗萃取的改进，装置如图，由,Kutcher&Steudel(1903,年,),发明（移动相为轻相），后由,Wehrli,改进为移动相为重相。,操作如图，先将水液放入管内，加入有机相使成液滴上升或下降萃取，到溢液管口后，流入接收瓶，接收瓶可用水浴加热，使溶剂汽化并进入冷凝管，再行滴入萃取。少量溶剂能起到大量溶剂的作用。但有时也有出现乳化，,Kutcher&Steudel,连续萃取装置只可用于少量的萃取（半微量），大量萃取时可根据此原理设计大型连续萃取器,连续萃取装置,逆流分配法（,counter current distribution CCD,法）：,又称为逆流分溶或反流分布法。其原理与简单萃取一样，装置是由用几十只或几百只萃取管组成。先将一相溶剂定量放入每一管内，然后将另一相依次放入第一管，放第二次时将第一管的萃取液转入第二管，这样依次重复到最后一管，每放入新鲜溶剂后，振摇一次。不同,k,值得化合物都可有不同管号的高分布，这样各化合物就彼此分开了。,此结果是机械振摇时管子破碎多，实验室可用分液漏斗代用。,液滴逆流分配法（,Droplet Counter Current Chromatography,DCCC,法,）,又称液滴色谱，日本谷村（东京大学）于,1971,年创立，实际上是,CCD,法的创新，也是由几十至几百个萃取管组成（内径,2.4,mm,，,高,60,cm,），,每管之间用内径,0.5,mm,聚四氟乙烯管串联，每25管为一板，可组合或分开使用。将固定相压入管后，再将样品溶液压入前几管，最后用氮气驱动移动相进入管内形成液滴分配。上行法，下行法均可进行。,由于液滴是与管内径一样大小，且旋转不断形成新的接触前进。因此分离效果远高于前几法。,例：柴胡皂苷,a,和,d,的液滴逆流色谱分离,影响因素,1、溶剂相对密度有关(两相),。,2、管内径有关,。,3、与氮气驱动速度有关,。,高速逆流色谱法（,hight speed counter currentchromatography,HSCCC）,由日籍美人,Y.Ito,于,上世纪中叶,发明该法，仍属分配色谱。其装置依靠聚四氟乙烯（,PTFE,）,蛇形管的方向性及特定的高速行星形式旋转所产生的离心力场作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连续逆流萃取分离物质的目的。,DCCC,以及,HSCCC,均可克服上述液相色谱中因为采用固体载体所引起的不可逆吸附消耗、样品变性污染及色谱峰畸形拖尾等弊病，样品还可以定量回收，目前已广泛用于皂苷、生物碱、酸性化合物、蛋白质、糖类等天然化台物的分离精制工作，并取得了良好的效果。,（三）沉淀法,利用改变提取液溶剂组成或加入一定试剂使有效成分或杂志，形成沉淀分离的一种方法。,1.,分级,沉淀法,在中草药总提物的水,提,液或醇提液中加入一定混溶的不同极性的溶剂来改变溶剂组成，使某些成分沉淀析出,水提液,（生物碱盐、蛋白质，淀粉）,加入,EtOH,水提液+蛋白质 +淀粉,（生物碱盐）,又称水提乙醇沉淀法，中草药制剂多用。,乙醚,皂苷,MeOH,或,EtOH,醇提液脂溶色素,皂苷,酸碱沉淀法（改变,pH,值使成分沉淀析出）,有机酸碱水液,pH3-4,游离酸,pH8-9,生物碱酸水液,游离碱,注意：实做时并不时越酸或越碱越好，要根据实际情况小样试后再放大。,醇醚沉淀法,乙醚,皂苷,MeOH,或,EtOH,醇提液,皂苷,+脂溶色素,（皂苷+脂溶色素）,2.,专属试剂沉淀法,在水或醇提液中加入有一定,沉淀范围的,试剂（沉淀剂），与有效成分形成不溶性的盐或络合物析出，而达到分离的方法。,中性醋酸铅：,COOH,化合物,酚（多为邻二酚）,有机酸，氨基酸，蛋白质，鞣质，,酸性树脂，酸性皂苷，某些黄酮,碱式醋酸铅：除以上部分还可沉淀其它具酚羟基、,醇羟基类化合物，某些多糖，生物碱，苷。,铅盐沉淀法,方法：,中性醋酸铅,提取液（水或稀醇）,铅盐（沉淀）,滤过,碱式醋酸铅,提取液（水或稀醇）,（或中性醋酸铅沉淀的滤液）,铅盐（沉淀）,滤过,脱铅（得到的铅盐 要脱铅才能拿到原成分）,悬浮于,EtOH,通,H,2,S，,滤过,铅盐沉淀,有效成分,+PbS,（沉淀）,由于,H,2,S,有毒，因此也有人主张用别的方法：,+,Na,2,SO,4,Na,3,P,2,O,7,饱和水液,PbSO,4,铅盐,+,H,2,SO,4,H,3,P,2,O,7,Pb,3,（P,2,O,7,）,2,+水液(有效成分),调,pH 3,但没有,H2S,脱铅彻底,铅盐+强酸性阳树脂+少量水,树脂,Pb+2 +,水液（有效成分）,搅拌,脱铅彻底，无毒，但树脂再生困难，成本较大,其它试剂沉淀法：,除醋酸铅外还有许多试剂可以与有效成分形成沉淀，如,:,季铵类生物碱,+,雷氏铵盐,生物碱雷氏盐（沉淀）,粘液质或酚酸性成分,+,Ca,（,OH,）,2,沉淀,鞣质,+,蛋白质（明胶）,沉淀,3.盐析法：,水提液加入,NaCl,等无机盐达到饱和，减低有效成分的溶解度，使其沉淀析出一种分离方法。,例：,NaCl,至饱和,三颗针,0.5%,H,2,SO,4,水提液,粗小檗碱,调,pH,至,2,3,（四）分馏法,用分馏柱进行蒸馏分离的方法，用于分离沸点差25以下（或80以下）混合物的分离，,原理见图所示,A（,低沸点）+,B（,高沸点）混合液体加热后成为蒸汽上升，碰到塔板后，相当部分的,B,和,A,开始冷凝，由于不断加热而产生的蒸气上升，使冷凝的,A,遇到再次上升的蒸汽后又汽化，再上升（完成一次热交换），,B,由于沸点高汽化上升的速度要比,A,慢，如此周而复始的循环，到了一定的高度，,A,和,B,逐渐分开，进而使,A,先蒸馏出来,B,后蒸馏出来，达到分离。,分馏柱效率评价,理论塔板数(值，,n)：,一个理论塔板数相当于一次理想蒸馏的效果.,n,大说明分离效果好(单位长度),理论塔板高度（,H,）：,H=L/n L,：,分馏柱的长度,H,小说明分离效果好,若液态混合物时处于恒沸状态，则用分馏结果分离不开的，只有用化学法或色谱法。,(五)膜分离法,利用具有很微细的微孔的过滤膜(天然或人工合成的高分子膜)，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液中的化学成分进行分离、分级、提纯和富集的方法。,微滤,超滤,膜分离,反渗透,电渗析,1.微滤(,micro filtration，MF),微滤膜常为均匀的多孔膜，孔道曲折，通常直接用测得的平均孔径来表示其截留特性。它的孔径分布较广，由0.0210,m，,膜厚50250,m。,能够截留直径0.0510 的微粒或分子量大于100万的高分子物质，操作压差一般为0.010.2,MPa。,原料液在压差作用下，可以截留大于膜孔的悬浮固体微粒、分子量大于10,6,的高分子物质、细菌等。,2.超滤(,ultra filtration，UF),超滤所用的膜为非对称膜，其表面活性分离层平均孔径约为10一200,，,能够截留分子量为500以上的蛋白质等大分子与胶体微粒，所用操作压差在0.10.5,MPa。,原料液在压差作用下大分子物质或胶体微粒被膜截留，不能透过膜，从而实现原料液中大分子物质与胶体物质和溶剂的分离。,3.反渗透(,reverse osmosis，RO),反渗透所用的膜称为半透膜，孔径0.11,m，,只能通过水(或有机溶剂)，不能通过盐类和其他溶解的物质。反渗透所用的工作压力高于超滤和微滤，一般为210,Mpa，,高于许多物质的渗透压，在这种压力作用下，溶液中的溶剂就会透过半透膜进入另一侧的溶剂中，使溶液浓度升高。这种作用和自然渗透的方向相反，故称为反渗透。反渗透技术主要用于医药化工的浓缩、分离、提纯、纯水（太空水、纯净水、蒸馏水）、海水淡化及废水处理等。,4 电渗析（,electrodialysis,ED）,电渗析所用的离子交换树脂膜有两类，一类只能透过阳离子，简称为阳膜，含有带负电的活性基团，能透过阳离子，但它的负电基能将溶液中的负离子排斥在外并阻挡其通过。另一类膜只能透过阴离子，简称阴膜，它通常含有带正电的活性基团，能透过阴离子，但排斥和阻挡阳离子。将阳膜和阴膜交替排列成多个组合，两侧置电极，在通入直流电后，溶液中的离子受相反电荷的电极吸引而相它移动，阳离子透过阳膜而被阴膜所阻挡，阴离子透过阴膜而被阳膜所阻挡。这样在阳膜与阴膜组合之间就积聚较多的电解质，成为浓缩液，而在阴膜与阳膜组合之内则较少，其离子趋近于零，成为淡化液。电渗析技术主要应用在海水的淡化，并逐渐扩大应用到电子、医药、化工、食品和环保等领域，用于去除水或提取液中的无机盐和离子型有机化合物。,微滤、超滤、反渗透及电渗析这四项膜分离技术在中药化学成分分离中目前处于早期应用阶段，尚有很多有待提高之处。,(六)结晶法,利用各成分在冷热的条件下溶解度或含量的差异（显著）进行液固分离的方法（重结晶和分步结晶法）。,原理,:,溶解度差异,热 冷,有效成分 大 小,杂 质 小 小,杂 质 大 大,含量差异,(,溶解度相近,),含量,有效成分 高,杂 质 低,过程,结晶是从混合物中拿单体的最后一步处理，也是最关键的一步处理。一般说，中药各类成分相当部分都为结晶体（多糖、蛋白质部分苷除外），因为只有拿到单体结晶才好做熔点等理化测定。作为初学者来说，结晶、重结晶学好了（应该是做好了），才算真正入了中药化学的门。,1.不同条件结晶法分离的运用,(1)分离有效成份和杂质,或,化合物,及,条件：溶剂一定,冷 热,有效成分 小 大,不溶性杂质 小 小,可溶性杂质 大 大,分离化合物,及,条件：溶剂一定,冷 热,化合物,小 大,化合物,大 大,利用两种成分含量的不同分离,条件：溶剂一定,热 冷,化合物（含量高）大 小,化合物（含量低）大,小,实例：汉防己总碱的分离与精制：,2.结晶溶剂的选择，制备方法及影响因素,(1)结晶溶剂的选择：,是结晶分离的关键条件，一般可查文献或自己摸,有效成分在热时溶解度大，冷时溶解度小，对杂质在冷、的条件下都大或都小。,不与结晶成分反应，易操作，价廉，易得，安全等。,可用混合溶剂结晶（易溶溶剂难溶溶剂，混溶），如氯仿丙酮，丙酮水等。,(,2),制备方法：,常法：,一般是一有结晶出现就滤出，往往头一批结晶纯度高，母液再分步结晶处理。若用上法难得到结晶再用下法处理：,玻棒摩擦瓶壁生晶,滴入另一种难溶的溶剂，至稍有一滴混浊，再加热全溶，静 置，冷藏析晶,加入同晶种生晶。（晶种加入若不溶说明饱和，若溶说明不 饱和）没有,晶,种可用玻棒蘸取溶液挥干再加入，或滴出几滴挥干再加入。,以上方法都不行可改换结晶溶剂（混合溶剂），或作成盐，乙酰化物等衍生物再行结晶。,（3）影响因素：首先是要纯，越纯越好结晶,浓度：太稀不饱和，太浓粘度大，都不利于结晶。适当回收，自然挥发处理。,温度：一般是越低越易结晶，但降温太快晶形不好，杂志多。先 定温，再冷水，后冰箱。,尽量保持静置，不要经常搬动。以免影响晶核的形成。,水溶性成份比脂溶性成分难结晶：苷、水溶性生物碱可用抽松技术，使成粉末后再用溶剂结晶。,以上几种方法要根据具体情况，灵活应用。,3.结晶纯度判断:单一化合物都可有结晶,结晶不一定是单体化合物。,外形：一定的晶形（均匀），色泽，可与文献值对照,注意不同溶剂，晶形有时不同，文献写法：黄色方晶（丙酮乙醇）,(2)色谱鉴定：,TLC,或,PC,三种不同的溶剂系统中,Rf,值与标准品一致 或一个斑点。,用,GC,或,HPLC,等仪器法鉴定更好。,熔点：与对照品及文献值对照，最好是混合熔点不下降 一般熔距在0.5度可判定纯，,越长说明越不纯。,注意点：,A,判定双熔点是化合物（两种晶格），如汉防己乙素（176溶200固242熔）。,B,与文献值核对结晶溶剂，溶剂不同有时熔点不同,C,极少数化合物熔距长，仍是单体,D,熔点为分解点的化合物以发泡温度为初熔点。,E,微量样品应用显微熔点测定。,F,先做,IR、UV,测定（样品可回收），最后再进行这种破坏性 的熔点测定。,(七,),色谱法,中药化学成分的现代分离技术和方法主要是色谱技术,目前欲从植物中分离出新化合物若用非色谱法分离难以拿到单体,有人对19791981年间的药学学报、中草药、,phytochemistry、planta medica（,德）、药学杂志（日）这五种杂志登载的植化论文中的分离方法进行了统计：,色谱法占,92.7%，,溶剂法,7.3%,，这些统计数据说明现许多植化实验室中的分离技术都是靠“一块板，一根柱”。,色谱法的基本原理与分类：,1.基本原理：,利用混合物中的各组分（包括单体化合物）在相对运动不相混溶的两相中分布（分配）程度及移行速度的差异进行混合物的分离。,2.分类：,气固（,GSC,）,很少用,气相色谱,气液（,GLC,）,多用（,GC,）,其中,HPLC和,GC,可认为是现代色谱方法，另几种称经典色谱法。其中液相色谱（,CC,），（,TLC,），（,PC,）,在植化中用得最多。可以说是常用法。（,IEC,）（,GFC,）,则要少一些。,GC,，,HPLC,由于制备量低，设备价格贵，因此用得更少,。,一、吸附色谱法（,Adsorption Chromatography,）,吸附色谱是利用各化合物极性上的差异进行色谱分离的。,（一）移动相、固定相与样品的关系,固定相、移动相和样品称色谱三要素，这三者之间的关系（主要是极性关系），可用下图表示：,样品,固定相,移动相,极性高,活性低,极性高,极性中,活性中,极性中,极性低,活性高,极性低,Stall,吸附色谱三因素关系图,1、固定相与样品的关系与选择,（1）氧化铝（亲水性吸附剂）,吸附力最强，载量大，它用于分离生物碱（脂溶）、皂苷元、萜等极性较弱亲脂性较强的成分。,醌、酸、邻二酚、糖等这样一些多氧基团取代结构的化合物易形成不可逆吸附，难以分离。,氧化铝有中性,PH7.5,，,碱性,PH9,10,，,酸性,PH4.5,三种，常用碱性分生物碱，中性分皂苷元，酸性用得较少。,注意：氧化铝是化学催化剂，可引起异构化、脱水、氧化等反应，用前小样试时应用,TLC,检查色谱前后的化合物变化,2.,硅胶（亲水性吸附剂）,吸附性载量都低于氧化铝，因此除了强水溶性成份（糖、蛋白质）一般成份均可分离（不会造成不可逆吸附），使用最广,。,注意：活化时应在,100,110,进行，避免硅醇基脱水成硅氧烷。,亲水性吸附剂在水中吸附力最强，用前，烘去水分称“活化”，适量加水“降活性”。,3.活性碳（拒水性吸附剂）,即在水中吸附力最强，亲脂性有机溶剂中最弱，故适用于分离水溶性成分（特别是糖类、氨基酸等）。,吸附规律：,A,极性基团多的极性基团少的,（,NH,2,OH,COOH,）,B,芳香族的脂肪族的,C,分子量大的分子量小的,洗脱剂：一般以不同浓度的乙醇由低浓度至高浓度洗脱。,规格：粉状炭:吸附容量大，流速慢（硅藻土助滤）,颗粒炭：吸附容量小，流速快（多用）,例：,洗脱剂 成分,洗 水 单糖 吸,脱 46EtOH,双糖 附,力 815%,EtOH,三糖 力,增 2030%,EtOH,四七糖 增,强,强,4.聚酰胺,由己内酰胺 聚合而成，分子中有酰胺键，,可与酚,OH,及或 形吸氢键吸附。,多用于分离酚、醌及酸类成分。,A,形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。,在水中吸附性最强，有机溶剂次之，碱性溶剂最弱。,吸附规律：,B,成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚 酰胺上的吸附即相应减弱。如：,C,分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之。则减弱。如：,5.,硅酸镁，硅藻土，滑石粉，,CaO（,亲水性吸附剂）,都属弱吸附性吸附剂，其中硅藻土可用于分配色谱分离强心苷，目前这几种吸附剂都用的较少，硅藻土常用做担体。,常用吸附剂的应用范围：,吸附剂,适用分离样品,氧化铝,生物碱、胺类、萜、甾体皂苷元,硅胶,除糖、蛋白质等水溶性强的成分外，其它脂溶性成分均可分离,活性炭,糖、苷类（少）氨基酸（少）,聚酰胺,酚、醌类成分,硅酸镁，硅藻土,一般用得较少，多用作担体,二凝胶过滤色谱(排阻色谱、分子筛色谱),凝胶过滤色谱主要利用混合物中各成分分子量差异进行分离。,原理:葡聚糖凝胶(,Sephadex G),是由葡聚糖(右旋糖酐)和甘油基通过醚桥(-,O-CH,2,-CHOH-CH,2,O-),相交联而成的多孔性网状结构小球颗粒，在水中可以溶胀，使网孔张开，当混合物溶液通过凝胶柱时比凝胶孔隙小的分子可以进入网孔内，在小球颗粒之间和网孔内向下移动，而比凝胶孔隙大的分子进不去，只能通过凝胶颗粒间隙向下移动。这样小分子在柱内所走的路程就比大分子长，走的速度就比大分子慢(被排阻)，保留时间长，比大分子后出柱，从而大小分子分离。故又称排阻色谱、分子筛色谱,常用商品凝胶的种类,1.葡聚糖凝胶(,Sephadex G),葡聚糖凝胶,(,Sephadex G),在有机溶剂中难以溶胀，有机溶剂比例大的流动相葡聚糖凝胶,(,Sephadex G),不能用。,2,羟丙基葡聚糖凝胶,(,Sephadex LH-20),由于引进了有一定亲脂性的羟丙基，羟丙基葡聚糖凝胶(,Sephadex LH20),不但能在水中,溶胀，也可在极性有机溶剂（混溶）中溶胀，除具有分子筛作用外，还可利用极性不同分离，其应用范围比葡聚糖凝胶,(,Sephadex G),大，还可分离部分脂溶性成分（少糖苷等）。,三离 子 交 换 色 谱,离子交换色谱主要利用混合物中各成分解离度差异(阴、阳离子及阴、阳离子强度)进行分离的色谱方法,离子交换树脂,原理,应用,离子交换色谱常用来将中药水提液的各成分分离成酸、碱及中性部位。,离子交换纤维素,离子交换凝胶,一树脂的结构及分类,（一）结构与分类,大孔吸附树脂（,Macroreticular Resin，Macroreticular adsorbents）,为一类人工合成的多孔(网状)性高分子聚合物吸附剂。,其吸附性能早期发现与活性碳非常相似，而且有许多活性炭所没有的特点。因此，自美国,RohmHaas,公司1996年合成出世界上第一种大孔树脂后，大孔吸附树脂合成的种类越来越多，在化工、食品、环保、医药上的应用也越来越广。,大孔吸附树脂化学结构系由简单小分子单体经交联剂聚合而成的高分子化合物。,4.大孔吸附树脂色谱,如由苯乙烯、二乙烯苯聚合的树脂及聚丙乙烯酸酯型树脂的结构片断如下：,1.,大孔吸附树脂化学结构,SFDA,要求中药新药用大孔树脂制备必须申报所用树脂的规格、聚合单体及交联剂等）,。,2,树脂的物理结构,由以上成千上万结构片断组成大孔吸附树脂的多孔网状物理结构，外观为直径约0.20.8,mm,的白色或微黄色小球,网孔为圆筒形、平板形、契形、细颈瓶形等，,具有一定的孔径（平均孔径,D,或,R,），,表面积（比表面积），孔容（孔体积），孔隙率（孔度），湿密度，干密度。,SFDA,规定，在中药新药制备中使用大孔吸附树脂，其制备工艺的申报资料中必须注明所用树脂的这些规格参数。,（,2,）中等级性：聚丙烯酸酯型聚合物，交联剂为甲基丙烯酸酯（也有文献称为“弱极性”）,（,3,）极性：如亚砜加交联剂，丙烯酰胺加交联剂。,不同,极性,的小分子单体及交联剂构成的树脂的极性是不同的，因此可按树脂的结构及极性的不同作如下分类。,3,.,大孔吸附树脂的分类,1,）非极性：苯乙烯、二乙烯苯聚合物。也称“芳香族吸附剂”,（,4,）强极性：如氧化氮加交联剂，乙烯吡啶加交联剂。,二,.,大孔吸附树脂的性质,室温下：不溶于水、稀酸（碱）、,MeOH、EtOH、Me,2,CO、CHCL,3,、,苯等。,GDX,系列树脂可耐250高温，,GC,用。,但据我们实验，,0.1,N NaOH,甲醇液久泡树脂，有轻微溶解现象。,（一）化学稳定性,（二）吸附性（洗脱,）,吸附性能与活性炭基本相同。,同时还具备一些活性炭所不具备的特点:,1.,对有机物的吸附选择性好，有无机盐存在时非但不影响对有 机物的吸附，反而会增强吸附。,2.,物理化学稳定性好，机械强度高，使用次数明显高于活性炭（,10,次以上）。,3.,再生方便，一般用水、稀酸（碱）、低级醇（,MeOH,，,EtOH,）、,丙酮即可再生，且分离纯化物灰分低。,4.,规格品种多，可根据不同需要合成出结构不同，极性不同的大孔吸附树脂，吸附分离不同的有机物。,5.,大孔吸附树脂为小球状，流动相洗脱时 阻力小，比粉状炭方便。,8.,水作溶剂时，加入无机盐，有利于有机成分的吸附，且无机盐易被洗脱剂洗脱，常随洗脱剂前沿 流出柱外。因此可代替半透 膜脱盐。,7.,常用水及不同浓度的,MeOH,、,EtOH,、,丙酮等低极性的醇或酮洗脱,其洗脱力随其浓度升高而增强。,10.,可用热水或蒸气解吸附挥发油。,9.,水,作溶剂时，少量醇或酮的存在，将极大降低树脂的吸附量。,6.,树脂为白色或微黄色，分离有色化合物时，易于观察判断谱带。,正是因为有这样一些特点，早在上世纪,66,年美国,Rohm&Hass,公司合成出世界上第一种大孔吸附树脂后,医药、环保领域内有很好的使用前途，并于,1974,年在北京的,一次学术会议上指出，大孔吸附树脂在,20,年内将取代活性炭吸附剂在各领域内的使用。目前看来确实如此。诸如在化工、环保、食品、医药等行业都已大规模使用大孔吸附树脂。我们中药制药的研究及生产中特别是,5,类药也在尽量采用大孔吸附树脂进行提取纯化，如甜叶菊苷，银杏叶提取物，人参总皂苷，金丝桃素提取物，挥发油等一些有效部位的提取，都采用大孔吸附树脂。中药,6,类新药研究也有许多人想用此技术。武汉市早在上世纪,70,年代即有人使用大孔吸附树脂制备老,2,类,(,新,5,类,),中药新药。,吸附剂名称,树脂结构,极性,比表面积,孔径（埃）,孔度（）,骨架密度,交联剂,生产厂名,（米,2,/,克）,（克,/,毫升）,Amberlite XAD-2,苯乙烯,非极性,100,200,37,1.07,二乙烯苯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-2,苯乙烯,非极性,330,90,42,1.07,二乙烯苯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-3,苯乙烯,非极性,526,44,39,二乙烯苯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-4,苯乙烯,非极性,750,50,51,1.08,二乙烯苯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-5,苯乙烯,非极性,415,68,43,二乙烯苯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-6,丙烯酸酯,中极性,498,63,双,-,甲基丙烯酸,二乙醇酯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-7,-,甲醛丙烯酸酯,中极性,450,80,55,1.24,双,-,甲基丙烯酸,二乙醇酯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-8,-,甲醛丙烯酸酯,中极性,140,250,52,1.23,双,-,甲基丙烯酸,二乙醇酯,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-9,亚砜,极性,250,80,45,1.26,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-10,丙烯酰胺,极性,69,352,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-11,氧化氮类,强极性,170,210,41,1.18,Rohm-Hass,（美）,AmberliteXAD-12,氧化氮类,强极性,25,1300,45,1.17,Rohm-Hass,（美）,Diaion HP-10,苯乙烯,非极性,400,小,二乙烯苯,Diaion HP-20,苯乙烯,非极性,600,大,二乙烯苯,Diaion HP-30,苯乙烯,非极性,500,600,大,Diaion HP-40,苯乙烯,非极性,600,700,小,Diaion HP-50,苯乙烯,非极性,400,500,型号,生产厂家,结构,极性,比表面（米,2,/,克）,孔径（埃）,上试,101,上海试剂厂,苯乙烯,非极性,上试,102,同上,同上,同上,上试,401,同上,同上,上试,402,同上,同上,南大,3520,南开大学,同上,非极性,南大,D1,同上,乙基苯乙烯,同上,南大,D2,同上,同上,同上,382,133,南大,D3,同上,同上,同上,南大,D4,同上,同上,同上,南大,D5,同上,同上,同上,南大,D6,同上,同上,同上,466,73,南大,D7,同上,同上,同上,712,66,南大,D8,同上,同上,同上,462,59,南大,DS2,同上,苯乙烯,同上,415,104,南大,DS5,同上,同上,同上,266,24,南大,Dm2,同上,-,甲基苯乙烯,同上,413,32,南大,Dm4,同上,新华大孔,100,华北制药厂,新华大孔,122,同上,新华大孔,1241,同上,新华大孔,CAD40,同上,MD,天津制胶厂,-,甲基苯乙烯,非极性,300,D,同上,同上,同上,400,100,DA,同上,丙烯睛,弱极性,200,300,三,.,树脂的使用方法,（一）树脂的预处理,树脂合成残留物毒性较大，应尽量去彻底。,若是免提树脂也要提一下,提取,时间可大大缩短。,（二）装柱、上样、洗脱、再生,2.上样：上样前的样品液，尽量用沉淀法或萃取法去除部分杂质，并以真溶液上样为好。,（,1,）,湿法上样：样品水液（尽量浓）以低流速上到树脂柱内。上样品以柱底流出液出现阳性反应为止，也可,静态吸附后，再上样。,（2）干法上样：样品低沸点有机溶剂溶液（,MeOH）,拌入树脂，水浴挥干，上至柱端。,上样量多少可小样预摸。,1.,4.再生：用过一次的树脂吸附容量大大下降，且含杂质，必须再生。一般可用,0.1,0.5,mol/L,的,NaOH,或,HCl,洗至树脂色变白或色显著变浅，再用蒸馏水或去离子水洗至中性。5.树脂用完保存最好是用醇泡，防止结冰或干碎而失去吸附活性。,3.,洗脱：一般为先用水洗至一定程度后，再用不同浓度（由低到高）的,MeOH,、,EtOH,、,丙酮等溶剂洗脱。具体条件可参考文献或预摸。,6.,有时有粘团、产气现象，影响分离，可用反冲洗解决。,四应用实例,1.银杏叶提取物的制备,目前中药提取纯化方面天津农药厂制的,D,101,型大孔吸附树脂用得较多（质量不一定最好，但价廉）。,2.,人参总皂苷的脱色,五,分 配 色 谱,利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数的不同进行分离的色谱方法。,分类,:,极性（亲水性）,化合物洗脱顺序,正相分配色谱,固定相大于移动相,亲水性成分后洗脱,亲脂性成分先洗脱,反相分配色谱,固定相小于移动相,亲水性成分先洗脱,亲脂性成分后洗脱,经典分配色谱,:,正相分配色谱,现代分配色谱,载体及固定相,颗粒直径多为,40,60,m（,中压）及,25,m,以下(,HPLC),的球形硅胶微粒，键合不同极性的固定相。如,Zorbax,系列高效液相填充柱的,反相分配色谱,流动相,除吸附色谱外，多用甲醇水，乙睛水及酸碱缓冲液等，加压分离。,制备分离规模,其中制备,HPLC,因仪器价格昂贵，目前应用最少。,组成天然有机化合物的元素仅为,C,、,H,、,O,、,N,、,Si,（,少）、,Cl,（,少）、,Br,（,少）、,S,（,少）等几种元素，但就是这几种元素经不同数量及排列方式的组合连接，形成近十万个结构种类复杂的天,然化合物。测定有效成分的结构式，实际就是测定其元素的组成种类、数量及组合连接方式，结构式测定的难度也就在这里。,有效成分结构式测定得正确与否不但对化学研究很重要，对随后进行的药理、药剂及药分的研究影响也很大。结构式一旦弄错，药理、药剂及药分研究都会出现相应的误差甚至错误。,第三节 中药有效成分化学结构的研究方法及程序,文献查阅归纳,理化实验测定,分析推导确定结构,测定化合物结构,一,、,文献查阅,此工作实际上在结构测定前已开始（定题时就开始了），根据植物的生源途径相同的原理查同属或同种的植物了解,：,（,1,）同种或同属植物中分离出哪几类成分,.,（,2,）这几类成分中各分离出哪些单体化合物。,（3,）总结归纳出查到的每一类成分每一个化合物理化数据，波谱特征（定性反应、,TLC,、,mp,、,UV,、,IR,、,MS,、,NMR,及测定条件和结构式）,（4）根据自己的提取分离过程中的实验现象（定性反应、,TLC,等），结合文献值（若有对照品最好）推测所提取的单体合物属哪一类成分（通常易推测，并多准），甚至是哪一个化合物。,二、实验测定,1.纯度,晶型,形状，色泽均应一致,.,TLC,三种以上的移动相展开，仍是一个斑点（可见，荧光，显色,）,熔点,熔距一般为,0.5,（但有些也可长一些）,与对照品或文献对照。最好是测混熔点，多测显微熔点。,初学者最好是做一个灼烧实验，以确定是否是有机物。,2.波谱及其它理化测定,测定所提的单体化合物是纯度的后，即可对化合物进行分子量、分子式（实验式）功能团的种类及位置测定。目前这些方面的测定工作多由波谱法进行（,UV,、,IR,、,MS,、,NMR,）。,（1）,UV,UV,属电子跃迁光谱，不同键型上的电子有不同的能级跃迁，在,200,400,nm,范围内其吸收波长（,max）,及强度（,）,也各有差异。有机物的价电子主要有,电子、,电子、,n,电子，其跃迁能级为：,其跃迁能量的大小顺序为（,E,顺序,）：,这几种价电子跃迁产生的吸收可归纳,：,UV,主要用于测定了解中药化学成分样品分子共轭体系结构及杂原子取代基的种类、数目及位置等部分结构数据及信息，如,利用,Woodvard,规则，计算推定共轭二烯类化合物的双键多少、位置及所连的助色团。,黄酮类成分可加入不同的试剂（位移试剂，诊断试剂）推定母核所连,OH,的多少及位置。,注意：相同化合物的,UV,相同，相同的,UV,化合物不一定相同,（2）,IR,为分子振转波谱，有机分子中不同基团的不同原子组成的键，其振动能级是不同的，因此用,4,000,cm,1,400cm,1,的红外电磁波扫描时可有不同的吸收峰。,其中：,40001500,cm,1,的区域为特征频率区，可对,中药化学成分样品分子,的特征官能团（羟基、氨基羰基、双键、芳环等）进行测定，以了解其取代基的种类、数目及位置部分结构信息。,1500,600,cm,1,的区域为指纹区，可在此区间将样品图谱与标准谱或对照品进行化合物的核对鉴别。,例如：,O,H,、,N,H,伸缩振动区,(3750,一,3000,cm,1,),碳基,(,C=0),的伸缩振动区,(1900,一,1650,cm,1,),：,不同类型取代芳环,C,H,弯曲振动,（3）,MS,测定化合物分子在真空条件下受电子流的“轰击”或其它方式“软电离”的作用，电离成分子离子和碎片离子所形成的质荷比,m/z,）,与丰度图谱。,主要了解中药化学成分样品分子的,部分结构片段信息,分子量,分子式,A、