分子遗传学-1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,参考书,路铁刚，丁毅。分子遗传学，高等教育出版社，2008,Gene VIII,Lewin,分子克隆实验（冷泉港）,绪论,基因与基因组,基因表达：,DNA,复制、转录、翻译,基因表达的调控,基因突变、损伤与修复,遗传重组与转座,基因与发育,基因与免疫多样性,表观遗传学,重要疾病发生的分子机制,基因组学与后基因组学,分子遗传学研究常用技术的原理,第一章,分子遗传学绪论,Gregor Mendel,（1822-1884）是遗传学的创始人,1865年豌豆杂种后代形性状分离实验，35年后又被重新发现,荷兰,Hugo de,Vires,(1848-1935),月见草杂交,F2,分离,德国,Carl,Correns,(1864-1933),杂种后代表现方式的,Mendel,法则,奥地利,Erich von,Tschermak Seysenegg,(1871-1962),关于豌豆的人工杂交,德国植物学会杂志，1900年18卷,分子遗传学的孕育阶段,1871年 Miescher核素,1902年，,Sutton 和Bover在观察蝗虫减数分裂过程中的染色体时发现，遗传因子的行为与配子形成和受精过程中的染色体行为是完全平行的,，并由此认为控制性状的遗传因子位于细胞核内染色体上，从而奠定了遗传的染色体学说（chromosome theory of inheritance）的基础。,Johansen,于,1909,年提出用“基因”（,gene,）一词代替,Mendel,“遗传因子”,1910年，Morgan(1866-1945)：果蝇近交实验：Gene 存在于染色体上,Morgan于1926年发表了著名的基因论，论述了基因在上下代之间的传递规律，认为基因控制相应的性状，基因可以发生突变、交换和重组。由此提出，基因既是一个功能单位，一个突变单位，也是一个交换单位的“三位一体”的概念。并预言基因是一个有机的化学实体。显然基因论对遗传学的研究产生了巨大的影响，也为分子遗传学的建立奠定了理论基础。,1923,年，英国医学与生物化学家,Garrod,根据对人体的一种先天性代谢疾病尿黑酸的研究发现该病是一种隐性遗传病。Garrod,的这种一个突变基因决定一种代谢障碍的观点在当时并未受到关注。,1941,年，,Beadle,和,Tatum,对粗糙脉孢菌（,Neurospora crassa,）的进化突变型进行研究时才发现了,Garrod,的工作，明确提出了“一个基因一个酶”（,one gene-one enzyme,）的理论。后来将“一个基因一个酶”改为,“一个基因一种多肽”（,one gene-one polypeptide,）。这表明基因是通过控制多肽的合成而影响生物遗传性状的发育和表达。,这些成果尽管证明了基因与蛋白质之间的对应关系，但仍未揭示基因究竟是什么物质组成的。其实，,Griffith,于,1928,年用细菌转化实验来证明遗传物质是,DNA,，他将活的无致病力的,R II,型肺炎球菌与灭活的,S,型肺炎球菌（存活时有致病力）分别注入小白鼠体后，小鼠仍然健康，但是当用,R II,型活菌与灭活的,S,型死菌共同注入鼠体后，则小鼠被感染死亡，在死鼠体中发现大量活的,S,型肺炎球菌。这意味着,S,型死菌的遗传物质使,R II,型转化为,S,型,Hershey,和,Chase,于,1952,用放射性同位素,35,S,和,32,P,分别标记噬菌体,T2,的蛋白质与核心,DNA,，发现在感染过程中蛋白质外壳留在宿主细菌体外，只有,DNA,进入菌体。在感染后约,25min,菌体被裂解，产生出,100-150,个完整的,T2,噬菌体。这个实验令人信服的表明，只有,DNA,是联系亲代与子代之间的遗传物质基础,Conrat 于1956年用一种RNA病毒烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）作为实验材料。TMV有一个圆筒状蛋白质外壳，由很多相同的蛋白质亚基组成。外壳内由一条单链的RNA分子沿其内壁在蛋白质亚基间盘旋。TMV中94是蛋白质，6%是RNA。如用RNA和蛋白质分别感染烟草，结果TMV的RNA可以感染，并形成完整的TMV。而TMV的蛋白质则无法感染烟草,二十年代，,Levene,研究了核酸的结构，并提出了四核苷酸假说。,Erwin,Chargaff,1949 DNA,是由四种脱氧核苷酸(,nucleotide)，,就是腺嘌呤(,adenine)、,鸟嘌呤(,guanine)、,胸腺嘧啶(,thymidine,),和胞嘧啶(,cytocine,),组成的，且在不同物种中四种核苷酸的比率不同。但,A,与,T,的量相等，,G,与,C,的量相等，即,A=T；G=C，,这就是所谓的,Chargaff,规则（,Chargaff,s rules）。,不同来源,DNA,分子中四种碱基的含量比较,分子遗传学的创立阶段,1950年，Wilkins用DNA晶体做X射线衍射分析，表明DNA有很精细的结构。就在此时，Wilkins的同事Franklin用含有较多水的DNA做X射线衍射分析。她从得到的图像中判定DNA是双螺旋结构。在DNA长链上，每个核苷酸相距0.34nm，每个螺距为3.4nm，由10个核苷酸组成。根据已测定的DNA分子宽度为2nm，推测DNA分子不止由一条链所构成（图1-10）。以上各项成果为DNA的双螺旋结构模型的提出奠定了重要的工作基础。,Rosalind Franklin,（19201958）,:The Dark Lady of DNA,（Harper Collins Publishers，2002）,布蓝妲 麦多克斯（Brenda Maddox）,2011年新诺贝尔化学奖颁发给她，以表彰她在DNA双螺旋上的贡献，但是对她已是太晚,Watson,和,Crick,在,1953,年,Nature,杂志上（,Vol 171,pp737-738）,发表“核酸的分子结构-脱氧核糖核酸的结构”（图1-9），这标志着遗传学乃至整个生物学进入分子水平的新时代。,在同一期3篇：,Watson，Wilkins，Franklin,DNA双螺旋结构模型与X射线衍射提供的螺旋构型的参数相吻合。其主要内容是：X射线衍射数据表明DNA具有规则的螺旋形式，,每34,（3.4nm）形成一整圈，其直径为20,（2.0nm）,由于临近核苷酸的间距是3.4,。由此每圈必定是10个核苷酸；糖磷酸组成的骨架处在DNA分子外侧，嘌呤和嘧啶碱基位于DNA内侧，,双螺旋中的两条多聚核苷酸链依赖碱基之间的氢键相连，,而且嘌呤总是与嘧啶配对。因而DNA直径保持不变；DNA分子中GC，AT。沿着任何一条DNA链，这四种碱基有多种多样的可能排列顺序，但任一DNA的组成可通过其碱基比例，即C+G来说明，不同物种比例从26到74不等；两条通过碱基间连接的DNA链称为互补链（complementary chain）。两条互补链呈反向平行的螺旋结构，碱基成对连接且垂直于螺旋的轴，每一碱基对沿着螺旋轴旋转36，所有10个碱基旋转成一圈完整的360。两条链相互缠绕形成一个带有小沟和大沟的双螺旋。,1956年Kornberg 等，1956在大肠杆菌的无细胞提取液中 实现了DNA的合成。这一工作获得了1959年的Nobel奖。,1958,年，,Meselson,Stahl,实验证实了该复制模型，他们将大肠杆菌置于含有较重同位素,13,C,和,15,N,的培养液中生长，这些细菌的,DNA,中含有,13,C,和,15,N,。然后将这些细菌转入只含,12,C,和,14,N,培养液中生长繁殖两代，每代都从细菌中抽提,DNA,，离心检测其密度，结果每代,DNA,形成的带与半保留复制的预期结果一致,1955,年，,Sanger,测定了牛胰岛素中氨基酸碱基的精确顺序,1958,年,Crick提出了中心法则，从而将核酸与蛋白质之间线性结构联系起来，并导致,1967,年“遗传密码字典”的问世。从,DNA,编码链上,5,端到,3,端方向的三联体核苷酸密码子（,triplet codon,）序列与蛋白质的,N,端到,C,端的氨基酸序列相对应，这种对应关系称为遗传密码（,genetic codon,）。,DNA,中的遗传信息是由信使,RNA,（,messenger RNA,mRNA,）介导而决定蛋白质的一级结构。,1961,年,Nirenberg,和,Mattheai,用酶促合成尿嘧啶核苷酸多聚物（,poly,（,u,）,），并将,poly(u),加入除去正常,mRNA,的细胞抽提物中，结果只合成苯丙氨酸连接成的肽链，这个结果表明,UUU,一定是苯丙氨酸（,Phe,）的密码子。,poly,（,A,）编码赖氨酸（,Lys,）肽链,poly,（,C,）编码脯氨酸（,Pro,）肽链,随后，用两种或多种核苷酸随机混合的多核苷酸替代,mRNA,，破译了部分氨基酸的遗传密码。到,1966,年,Khorana,用两种或三种核苷酸重复组成的多核苷酸，如,GUGUGU,，,AAGAAG,和,GUUGUU,等做实验，终于破译了所有编码氨基酸的密码子,由于密码子的三个碱基位置都有,4,种可能，因此有,4,3,=64,种可能的三联体核苷酸序列，其中,61,个密码子编码各种氨基酸，,3,个密码子使蛋白质合成终止，故称终止密码子（,termination codon,）。密码子编码何种氨基酸是由与之相应,tRNA,决定的，而终止密码子的识别则是由蛋白质因子直接决定的。由于编码氨基酸的密码子数量为,61,个，远比氨基酸数量,20,个多。所以几乎所有的氨基酸都由一个以上的密码子编码，只有甲硫氨酸和色氨酸除外。几种密码子编码同一种氨基酸，这称为密码子的简并性（,degeneracy of the codon,）。编码同一种氨基酸的两种以上的密码子称为简并密码子（,degenerate codon,）或称同义密码子（,synonym,）,从简并密码子可以看出前两个核苷酸都是相同的，第三个核苷酸则是变动的，一般不是特别重要。密码子最后一位碱基因特异性降低的现象称为第三碱基的简并性（,third-base degeneracy,）。,Khorana,，,证实了,Nirenberg,所破译的遗传密码获得了1968年的诺贝尔奖。,1961年，,Jacob,和,Monod,操纵子学说,Robert Holley，,tRNA,结构,1970,年，,Temin,和,Baltimore,发现逆转录酶。,阿尔伯(,Arber,)、,史密斯(,Smith),和内森斯(,Nathans,)，,发现限制性内切酶,获1978年诺贝尔生理学和医学奖。,Sanger,设计测定,DNA,分子内核苷酸序列，1980年与伯格,(,Berg)（,重组,DNA,技术）分享,Nobel,生理医学奖。,1989年,Altman、,Cech,发现核酶共享,Nobel,化学奖.,Mullins，1990,发明,PCR,技术,Watson,等，1990 启动人类基因组计划,1995,年，,Venter,and Smith，,完成原核生物,Hemophilus influenzae,的基因组测序,1996年，完成啤酒酵母的基因组测序,1997年，,Blattner,and,Horiuchi,等，完成大肠杆菌的基因组测序,2000年，人基因组草图测序完成,2001年，拟南芥菜,2002年，水稻,此外，果蝇、线虫及一些微生物的基因组测序完成,显微注射术开始转基因动物的研究,转基因植物的诞生,基因治疗技术,克隆技术,人类基因组计划,植物基因组计划,功能基因组学,1.3 中心法则及其发展,1958,年，,Crick,在“论蛋白质合成”一文中又提出了中心法则来说明遗传信息的传递方向和途径。,基本内涵是,Crick,的序列假说（,sequences hypothesis,），即“核酸片段的特异性完全由其碱基序列所表达，而且这种序列是相应蛋白质的氨基酸序列的密码”。因此中心法则是序列转换的法则，即基因的,DNA,序列与其转录的,RNA,序列和蛋白质的氨基酸序列是有严格的共线性，也就是说，遗传信息的传递是通过严格的序列对应来实现的,1.3.2 RNA编辑与中心法则,某些mRNA前体的核苷酸序列尚需加以改编，方能变成有活性的正确的翻译模板。结果使成熟mRNA的核苷酸序列不同于前体，也不同于模板，使遗传信息在mRNA水平上发生改变。,广泛存在于原生动物及植物细胞的线粒体。,编辑过程包括mRNA前体分子中插入、剔除或置换。,方向：35,指导RNA（guide RNA)和酶参与,RNA编辑说明生物体不仅以基因组DNA为中心复制、传递和表达遗传信息，而且还可以在RNA水平上对DNA编码的遗传信息再加工，编辑产生新的遗传信息或校正发生差错的遗传信息。,1.3.3 朊病毒与中心法则,朊病毒（,prion,）一词是,Prusiner,于,1982,年提出的。,Prusiner,对朊病毒的创造性研究使其于,1997,年获得诺贝尔奖。该病毒是一类感染性蛋白质因子，它能引起人的库鲁病，吉雅氏病，吉斯综合症，动物的羊瘙痒病，牛海绵样脑软化病即疯牛病等。朊病毒不含核酸，是一种蛋白质病原体。朊病毒相关蛋白，是由细胞基因,PrP,编码。,这种蛋白质与蛋白质之间的遗传信息的传递对中心法则的蛋白质不能输出遗传信息的概念是一个挑战。当然在正常人体内，PrP基因的表达形成prpc的程序仍然是符合中心法则的，因此，prpsc的产生是对中心法则的补充或修正。,活动复制机制,朊病毒具体的活动和复制机制还不是很清楚。,朊病毒(prion)的检测,推测朊病毒仅由蛋白质组成，没有核酸。一种学说认为朊病毒的蛋白质能为自己编码遗传信息。这种假说与传统的分子生物学中的“中心法则”是相违背的，因为朊病毒没有核酸。于是人们假设朊病毒的复制可能的方法，一认为是通过逆转译过程产生为朊病毒编码的DNA或RNA（如后者情况还需要逆转录）必须存在逆转译酶，甚至还要有,逆转录酶,。二为蛋白质指导下的蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗传信息。在这之前，科学家认为所有的病原体都有可复制的核酸（细菌、病毒等等）。,最引起当今科学家兴趣和关注的是朊病毒的复制机理。由于朊病毒是一种只含有蛋白质而不含核酸的分子生物并且只能在寄生,宿主,细胞内生存。因此，合成朊病毒所需的信息，有可能是存在于寄主细胞之中的，而朊病毒的作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒的编码的基因，使得朊病毒得以复制繁殖。,研究人员发现了一个突破口：这种具有感染性的因子主要由被称为PrP的蛋白质组成的。这种蛋白质可以在细胞的质膜上找到（具体功能还不了解），但是与具有感染性的因子PrpSC与正常因子PrPC在形状上有一点不同。科学家推测这种变形的蛋白质会引起正常的PrPC转变成具有感染性的蛋白质，这种连锁反应使得正常的蛋白质和致病的蛋白质因子都成为新病毒的材料。在这个假说被提出来以后，产生PrP的基因被抽离出来，产生不同形状的突变基因被成功的定义和复制，研究实验鼠的结果为这个假说提供了支持，这些证据是强有力的，但并不是无可争议的。进一步研究发现，朊病毒蛋白是人和动物正常细胞基因的编码产物（人的该基因位于第20号,染色体,短臂）。,1.4 基因概念及其发展,孟德尔：遗传因子（,inherited factor,）,Johannsen,：基因,Garrod,的“一个突变基因一个代谢障碍”的观点表明了基因的功能,Beadle,和,Tatum,提出的“一个基因一个酶”的理论，补充为,“一个基因一个多肽”,顺反子：是遗传上的一个不容分割的功能单位。一个顺反子就是一个功能水平上的基因，故顺反子也就是基因的同义语，每个顺反子在染色体上的区域称为基因座（gene locus）。顺反子既有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性,1.4.2 操纵子与基因家族,1961,年法国遗传学家,Jacob,和,Monod,提出了大肠杆菌乳糖操纵子模型来阐明原核生物基因表达的调控机制。根据该模型，基因又分为：结构基因（,structure gene,），即编码产生多肽链或,RNA,产物的基因；操纵基因（,operator,），该基因有阻遏物结合的位点，当阻遏物与操纵基因的结合位点结合时，三个结构基因就失去转录活性，不合成三种酶分子；起始基因（,initiator,），系,RNA,聚合酶结合位点，起始,RNA,的合成；调节基因（,regulatory gene,），它编码阻遏物、调节结构基因的活性。操纵基因与由它操纵的几个结构基因连锁在一起，并由一个启动子（,promoter,）转录成为一个,mRNA,分子，然后翻译出各自的蛋白质，这样的结构称为一个操纵子（,operon,），,1965年获得诺贝尔奖。,原核生物中的操纵子结构在真核生物中很少发现，真核生物的结构基因一般是单独调控的。但真核生物中存在基因家族（,gene family,），即真核生物基因组中有一些来源相同，即通过某一个祖先基因的复制和变异而传递下来的、结构相似、功能相关的基因，这样一组基因称为一个基因家族。基因家族中的各个成员可以聚集成簇，也可以分散在不同染色体上，或者两种情况兼而有之。,1.4.3 外显子与内含子,自从,1977,年Berger,、,Broker,和,Sharp,等人发现某些基因编码序列是不连续的，故称不连续基因（,discontinuous genes,），或称为断裂基因（,interrupted genes,），即在一个基因内被不编码蛋白质的,DNA,序列分割成几个不连续的部分。将编码蛋白质的序列称为外显子（,exon,），非编码序列称为内含子（,intron,）。现已知绝大多数真核生物基因都是断裂基因，而原核生物的基因结构大多数是连续的，只有少数细菌基因中发现有内含子序列,“跳跃基因”和“断裂基因”,McClintock B玉米转座子；绝大多数真核生物基因是不连续的-断裂基因；1978年在噬菌体中发现重叠基因，一个基 因序列可以被包含在另一个基因中，两个基因序列可能部分重叠,结构基因(,Structural genes),与调节基因(,regulatory genes)：,这类基因不仅可以转录为,mRNA,，,而且可以翻译成多肽链，从而构成各种结构蛋白或催化各种生化反应的酶。调节基因的作用是调控其它基因的活性，调节基因可以转录成,mRNA,，,然后再翻译成阻遏蛋白或激活蛋白,核糖体,RNA,基因：只转录成相应的,RNA，,不翻译成多肽链。,rDNA,专门转录核糖体,RNA(,rRNA,)，,rRNA,与相应的蛋白质结合形成核糖体，为,mRNA,翻译成多肽链提供场所；,tDNA,专门转录成转移,RNA(,tRNA,)，,tRNA,的作用是激活和转移氨基酸,启动子与操纵子：前者是转录时,RNA,聚合酶启始与,DNA,结合的部位，后者是调节基因的产物阻遏蛋白或激活蛋白与,DNA,结合的部位。,基因的类别及其相互关系,外显子与内含子,1977年由法国的Chambon等和美国的Berget等首次报道了基因内部有间隔序列，就是一个基因往往由几个互不相邻的段落组成，内部则被长短不一的核苷酸对的间隔序列所隔开。由DNA序列中被转录成为mRNA片段的序列称为外显子(exon)，而在成熟的mRNA上没有反映出的核苷酸区段成为内含子(intron)。高等生物中大多数基因都有内含子，原核生物的基因一般没有内含子。,有利于储存较多的信息，增加信息量：通过不同的剪切方式可以编码多种不同的蛋白质,有利于变异和进化：通过不同的剪切方式编码多种不同的蛋白质，在进化上的作用非常重要。单个碱基的改变有时可以引起氨基酸的变化，但较难产生重大改变的蛋白质。,增加重组几率：内含子有可能不断的增减造成新的剪切方式，一方面形成新的基因，另一方面在剪切过程中增加重组几率，同时由于内含子的存在使得基因长度增加，增加了重组频率。,对于基因表达的调控作用,断裂基因的意义,Sanger 1978年分析OX174噬菌体,含有9个基因，共2000个氨基酸,按三联体密码子原则应有：6000个核苷酸,实际只有：5386个核苷酸有些密码子是可以重读的-重叠基因发现,传统的观点认为每个基因是由一些密码子组成，而这些密码子是有序地排列在DNA链上，各个基因也是按次序地阅读下去，1978年Sanger在单链DNA噬菌体中发现组成基因的核苷酸序列有些可以重读，因而出现重叠基因(overlapping gene)。,重叠基因就是两个或两个以上的基因共用一段DNA序列。,重叠基因的发现,大基因包含小基因,前后两个基因首位相接,DNA,序列-,T-A-A-T-G,DNA,序列,-,A-T-G-A,三个基因之间三重重叠,DNA,序列-,T-T-C-T-G-A-T-G-A-A-A,4.,反向重叠：,DNA,双连都转录，密码读框相同，但方向不同，转录产物相互干扰，有强有弱,5.重叠操纵子：重叠基因不仅仅是结构基因的重叠，也有结构基因与调控基因之间的重叠以及调控序列之间的重叠,重叠基因的重叠方式,