原核基因的表达.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,引言,原核生物和单细胞真核生物没有核膜和明显的核结构，直接暴露在变幻莫测的环境中，本身既无足够的能源储备，又无高等植物那种制造有机物的本领，食物供应毫无保障，只有能根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程,适应环境的变化,，才能维持自身的生存和繁衍。它有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制。,如果每个基因等同翻译，每一个多肽应有相同的拷贝数。,结论是否定的,，,基因的表达是被控制的。,有些蛋白质的数目相当固定，另一些则变化很大；50种核糖体蛋白数量十分稳定。糖酵解体系的酶数目也极恒定。DNA聚合酶、RNA聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质,（组成型或永久型合成合成蛋白）,的合成速率不受环境变化或代谢状态的影响。,而另一种类型则被称为,适应型或调节型,(adaptive or regulated),，这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。,例如，一般情况下，一个大肠杆菌细胞中只有15个分子的-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每个细胞中这个酶的量可高达几万个分子。其他参与糖代谢的酶，氨基酸、核苷酸合成系统的酶类，其合成速度和总量都随培养条件的变化而改变。,基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念。,基因表达调控,(gene regulation),：,对从,DNA,到,mRNA,再到蛋白质这个过程的调节就称为基因表达调控。,原核细胞基因的表达调控主要在,转录水平上进行。,生物基因组的遗传信息并不是同时全部都表达出来的,，大肠杆菌基因组含有约4000个基因，一般情况下只有510%在高水平转录状态，其它基因有的处于较低水平的表达，有的就暂时不表达。,不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同，这就是,基因表达的组织特异性。,例如肝细胞中涉及编码鸟氨酸循环酶类的基因表达水平高于其它组织细胞，合成的某些酶(如精氨酸酶)为肝脏所特有；胰岛细胞合成胰岛素；甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)专一分泌降血钙素等。,细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的，这就是,基因表达的阶段特异性。,一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信息，在个体发育分化的各个阶段，各种基因极为有序地表达，一般在胚胎时期基因开放的数量最多，随着分化发展，细胞中某些基因关闭、某些基因转向开放。,胚胎发育不同阶段、不同部位的细胞中开放的基因及其,开放的程度不一样,，,合成蛋白质的种类和数量都不相同，,显示出基因表达调控在空间和时间上极高的有序性，从而逐步生成形态与功能各不相同、极为协调、巧妙有序的组织脏器。,从上所述，不难看出：,生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受着严密、精确调控的，不仅生命的遗传信息是生物生存所必需的，而且遗传信息的表达调控也是生命本质所在。,基因表达调控主要在两个水平上体现：,(1)转录水平上的调控,(transcriptional regulation);,(2)转录后水平上的调控(post-,（transcriptional regulation)，,包括：,mRNA加工成熟水平上的调控,翻译水平上的调控,控制转录这一步反应是最有效的和最经济的。,原核生物中的,操纵子,系统就是这种最经济和最有效原则的体现。它把生物活性相关的基因组织在一起，就不必逐个进行调控，而是一开俱开，一关全关。,7.1.1 原核基因调控机制的类型与特点,原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为,负转录调控,(negative transcription regulation),正转录调控,(Positive transcription regulation)。,负转录调控系统,负转录调控,：调节基因产生阻遏蛋白(repressor)，与操纵区结合阻止结构基因转录。作用部位是操纵区。,负控诱导,：阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。,负控阻遏,：阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。,正转录调控系统,正转录调控,：调节基因产生激活蛋白(activator)，激活蛋白结合与DNA的启动子及RNA聚合酶后，转录才会进行。,据激活蛋白的作用性质：,正控诱导,：诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。,正控阻遏：,效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行。,7.12 原核基因调控的主要特点,1.可诱导调节：,基因在特殊物质的作用下，由原来关闭的状态转变为活化状态称为,诱导调节,。,大肠杆菌在只含乳糖的培养基中开始时生长不好；等合成了利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源的能力时又开始生长。,怎样获得这一能力的：在诱导物乳糖的诱导下开动了乳糖操纵子，表达它所编码的3个酶。这3个酶使细菌可以利用乳糖作为碳源。象乳糖操纵子这类基因就是,可诱导基因,，,这类酶被称为,诱导酶,，这个生化过程被称为,酶的诱导合成。,可诱导的操纵子,是一些编码分解代谢糖和氨基酸的蛋白的基因。这些糖和氨基酸平时含量很少，细菌并不分解利用它们，而是利用一般的能源物质葡萄糖的水解来提供能源，因此，这些操纵子常常是关闭的。一旦生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖作为能源时，就要打开这些基因。,2.可阻遏调节,基因平时是开启的，处在产生蛋白质的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。,比如大肠杆菌生活中必须有色氨酸，一般情况下，该操纵子开启，生产色氨酸合成酶基因表达正常。如果在细菌培养基中加入色氨酸，细菌可利用它来维持生活而不需要再合成，细菌就在2-3min内关闭该操纵子。,某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以被这个产物本身所关闭。这种基因被称为,可阻遏基因,，这些酶被称为,可阻遏酶,，这个现象被称为可阻遏现象，这些起阻遏作用的小分子被称为,阻遏物,。,可阻遏基因,它们是一些合成各种细胞代谢过程中所必须的小分子物质(如氨基酸、嘌呤和嘧啶等)的基因，由于这类物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的。只有当细菌生活环境中有充分供应时，才关闭这些基因，停止其合成。,参与大肠杆菌中基因表达调控最常见的蛋白质可能,是因子,，共存在六种因子（ZP234表7-2），其中70,是调控最基本的生理功能如碳代谢、生物合成等基因的转录所必须的。,除参与氮代谢的,54,以外，其它5种因子在结构上具有同源性，所以统称,70,家族,。,所有,因子都含有4个保守区,，其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA解开成单链的过程。,与上述因子特异性结合DNA上的-35区和-10区不同，,54,因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合。,在与启动子结合的顺序上，,70,类启动子在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子区相结合，而,54,则类似于真核生物的TATA区结合蛋白（TBP），可以在无核心酶时独立结合到启动子上。,7.13.弱化子对基因活性的影响,当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段DNA序列被称为,弱化子,。,在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。,当基因转录使转录产物（RNA）到不同长度时，核糖体会在对应的RNA位置上；此时,RNA可以形成某种形式的二级结构,；由此决定延伸复合物的结合能力，从而决定基因能否继续转录。,起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶的浓度，因此是转录调节中的微调整，好比无线电调谐器中的微调一样，只要稍加变动就可影响整个体系的功能。,7.1.4,降解物对基因活性的调节,葡萄糖效应,（降解物抑制作用）,：,有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，产生出代谢这些糖的酶来。,为什么会产生这种效应呢？,因为添加葡萄糖后，葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。葡萄糖的存在会,抑制细菌的腺苷酸环化酶活性,，减少环腺苷酸（,cAMP,）的合成，因而不能与环腺苷酸受体蛋白,CRP（,分解代谢物激活蛋白,CAP）结合。,降解物抑制作用,是通过提高转录强度来 调节基因表达的，是一种积极的调节方式。,7.1.5 细菌的应急反应,细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌会产生一个应急反应停止包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质的几乎全部生物化学反应过程。,实施这一应急反应的信号是,鸟苷四磷酸,(ppGpp)和,鸟苷五磷酸,(pppGpp)。产生这两种物质的诱导物是,空载tRNA,。,当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的,空载的tRNA,，会激活,焦磷酸转移酶,，使ppGpp大量合成。,ppGpp,的出现会关闭许多基因，以应付这种紧急状况。ppGpp 影响RNA聚合酶与这些基因转录起始位点的结合，使基因被关闭。,ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们影响一大批操纵子而被称为,超级调控因子,。,7.2 乳糖操纵子负控诱导系统,操纵子模型是与特殊代谢途径有关的基因转录的协同调控模型。操纵子是基因表达和调控的单元.,典型的操纵子包括:,结构基因,：编码那些在某一特定的生物合成途径中起作用的、其表达被协同调控的酶。,调控元件：,如操纵序列，是调节结构基因转录的一段DNA序列。,调节基因,：其产物能够识别调控元件，例如阻抑物，可以结合并调控操纵基因序列。,7.1.1 引言,乳糖操纵子是第一个被发现的操纵子，我们以它为例说明原核细胞操纵子结构与调控机制,。,Francis Jacob,Jacques Monod,1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不断完善。获1965年诺贝尔生理学和医学奖。,7.2.1 乳糖操纵子的发现,1）.大肠杆菌“二次生长”现象,1940年，Jacob和 Monod在培养大肠杆菌时,对大肠杆菌的生长进行了研究。当把大肠杆菌培养在有葡萄糖和乳糖的培养基上时，发现了其特殊的生长现象。,时间,大肠杆菌二次生长曲线,ZP242图7-11,大肠杆菌生长曲线,葡萄糖耗尽,乳糖存在,-半乳糖苷酶活性,7.1.2 乳糖操纵子的发现,研究说明：,大肠杆菌在,含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，,优先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，大肠杆菌的生长会出现停顿。经过短时间的适应，诱导出了利用乳糖的酶，就可以分解利用乳糖，继续生长繁殖。即产生“二次生长现象”。,7.1.2 乳糖操纵子的发现,大肠杆菌利用乳糖需要三种酶：,-半乳糖苷酶、,透过酶,酰基转移酶。,7.1.2 乳糖操纵子的发现,2）乳糖的加入和去除对酶的诱导的影响。,E.coli,Glu.,E.coli,Lac.,分别检测菌体内-半乳糖苷酶和透过酶的量,7.1.2 乳糖操纵子的发现,将大肠杆菌培养在以乳糖为唯一碳源的培养基中，几分钟后，检测菌体内-半乳糖苷酶和透过酶的量，然后将乳糖培养基换为葡萄糖培养基，培养一段时间，再检测菌体内-半乳糖苷酶以及透过酶的量，根据实验数据得到下面曲线。,时间,-半乳糖苷酶和透过酶的量的变化,加入乳糖,去掉乳糖,-半乳糖苷酶,透过酶,诱导物的加入和去除对,-半乳糖苷酶和透过酶的,影响,环境中加入乳糖时，菌体内-半乳糖苷酶和透过酶的表达的量呈直线上升，去掉乳糖时，-半乳糖苷酶和透过酶的量不再增加。,结论：,乳糖能诱导利用乳糖的-半乳糖苷酶和透过酶的表达。,3）诱导产生的酶是由酶前体转化而来的，还是新合成的？,把大肠杆菌细胞放在有放射性,35,S,标记的培养基中,（无诱导物），,繁殖几代，检测不到-半乳糖苷酶，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到,不含,35,S,的培养基中，随着培养基中乳糖等,诱导物的加入,，利用乳糖的-半乳糖苷酶便开始合成。分离-半乳糖苷酶，发现这种酶,无,35,S,标记。,大肠杆菌,35,S,无诱导物,培养几代,检测不到,-半乳糖苷酶,分离纯化,无,35,S,有诱导物,培养几代半乳糖苷酶合成,无,35,S,大肠杆菌,结论：,酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。,为什么乳糖加入后，利用乳糖的酶就能被诱导呢？,操纵子（opron）：,一种完整的具有特定功能的原核细胞的基因表达和调节的单位。它由,调节基因、启动基因、操纵基因以及一组功能相关的结构基因组成。,7.2.2 乳糖操纵子的结构,乳糖操纵子,调节基因,I,启动基因,P,操纵基因,O,结构基因,Z,Y,A,（lactose opron）,7.2.2 乳糖操纵子的结构,lacZYA转录单元含有一个操纵基因位点lac0，它位于lac启动子P的5端的-7至+28之间。该位点可被乳糖阻抑物相结合。,当该蛋白结合到操纵基因上时，便成为转录的强抑制物。,乳糖阻抑物被一个独立的调节基因lacI所编码，lacI也是乳糖操纵子的一部分;lacI位于lacP的上游。,I,P,O,Z,Y,A,DNA,调节基因,启动基因,操纵基因,半乳糖苷酶,透过酶,乙酰基转移酶,RNA聚合酶结合位点,28,30,29,7.1.3 乳糖操纵子的结构,1)结构基因群,(,编码蛋白质的基因),(structural gene),Z,：编码,-半乳糖苷酶,；它是水解-,半乳糖苷键的专一性酶，,Y,：编码,透过酶,；是使外界,的乳糖能透过大肠杆菌细胞壁和原生,质膜进入细胞内。,A,：编码,乙酰基转移酶,；作用是把乙酰,辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷,上，形成乙酰半乳糖。,7.1.3 乳糖操纵子的结构,乙酰基转移酶,不参与乳糖代谢,。,在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，若积累抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后不能被分解，所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累。,结 构 基 因,转录,mRNA,翻译,Z,Y,A,透过酶,-半乳糖苷酶,乙酰基转移酶,产生的这三种酶是如何来分解乳糖的呢？,乳糖的利用及其相关的酶:,乳糖（外界）,透过酶,乳糖（细菌内）,半乳糖苷酶（少量）,异乳糖,半乳糖苷酶,葡萄糖+半乳糖,半乳糖苷酶（大量）,乙酰基转移酶,代谢,2)启动基因,启动基因promoter,P)：指,能被,RNA聚合酶,识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,它,一般位于第一个结构基因,5端上游,，控制整个结构基因群的转录。,I,P,O,Z,Y,A,DNA,调节基因,启动基因,操纵基因,半乳糖苷酶,透过酶,乙酰基转移酶,RNA聚合酶结合位点,28,30,29,3)操纵基因,操纵基因,（operator O）：是指能被,调控蛋白,特异性结合的一段DNA序列。,操纵基因,与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵基因上，会影结构基因的转录。,I,P,O,Z,Y,A,DNA,调节基因,启动基因,操纵基因,半乳糖苷酶,透过酶,乙酰基转移酶,RNA聚合酶结合位点,28,30,29,4）调节基因,调节基因,(regulatory gene I)：是,编码,调控蛋白,的基因。,调节基因位于启动基因邻近处，往往与启动基因隔一段距离，有,其自身的启动基因,，编码产生的,调控蛋白,能与操纵基因结合影响结构基因转录。,I,P,O,Z,Y,A,DNA,调节基因,启动基因,操纵基因,半乳糖苷酶,透过酶,乙酰基转移酶,RNA聚合酶结合位点,28,30,29,7.2.3 乳糖操纵子的负调控机理,当大肠杆菌在,没有乳糖,的环境中生存时，调节基因转录的mRNA表达为阻遏蛋白，形成有,活性的四聚体,，并能特异性与操纵基因紧密结合，,阻碍了RNA聚合酶与启动基因的结合，从而阻止结构基因的转录，此时，乳糖操纵子处于阻遏状态，也称为“关闭”状态；,操纵子处于阻遏状态时，三种结构基因是否一点都不表达呢？,当我们说一个系统处于“关闭”状态时，也有,本底水平,的基因表达，,阻遏蛋白的阻遏作用,不是绝对,的，它,偶尔与操纵基因解离，使细胞中还有,极低,水平的,半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的,生成。,所谓“关”不是不表达，常常是每个细胞只合成,1,或,2,个,mRNA,分子。只是基因表达量特别低，很难检测。,当,有乳糖,存在,时，乳糖受少量,半乳糖苷酶的催化转变为,别乳糖,，与阻遏蛋白结合，使其构象变化，四聚体解聚成单体，失去了与操纵基因的亲和力，因而就不能结合到操纵基因上，基因,转录开放，,这是乳糖对乳糖操纵子的,诱导,作用。,一些化学合成的,乳糖类似物,，不受,半乳糖苷酶的催化分解，却也能与阻遏蛋白特异性结合使其构象变化，诱导,lac,操纵子的开放。,例如,异丙基硫代半乳糖苷,(IPTG),、巯甲基半乳糖苷,（TMG),就是很强的诱导剂；不被细菌代谢而十分稳定。称,高效诱导物或安慰性诱导物。,X-gal,（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物因此可以用作半乳糖苷酶活性的,指示剂,。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。,当加入乳糖时为什么能诱导出利用乳糖的酶的合成当去掉乳糖时为什么酶的表达不再增加。这种酶的阻遏与诱导是通过乳糖操纵子的负调控产生的。,7.1.4.1 乳糖操纵子的负调控,综上所述，乳糖操纵子属于,可诱导的操纵子，这类操纵子在没有诱导物的时候通常是关闭的，当受诱导物作用后，诱导开放转录。,原核细胞的这类操纵子使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境提供的能源底物。,在含有乳糖和葡萄糖的培养基上，大肠杆菌为什么优先利用葡萄糖，只有葡萄糖耗尽时，才利用乳糖呢？还有，即使去掉阻遏物并不能很好地启动结构基因表达,说明还有其它因素参与，这涉及到乳糖操纵子的另一种调控方式正调控。,7.2.4.CAP的正调控,1965年，Sutherland 发现大肠杆菌培养液中葡萄糖的含量总是与cAMP含量成反比。,1968年，发现大肠杆菌培养液中加入cAMP可增加半乳糖苷酶的产量,Plac启动子不是强启动子。,其原因是Plac及其相关的启动子没有强的,-35序列,，其中一些甚至只有弱的,-10的共有序列。为了实现高水平的转录，它们需要一种特定的激活蛋白即cAMP受体蛋白(CRP)的活化。,cAMP在生物表达调控过程中起着重要作用。葡萄糖降解物能抑制细胞内cAMP产生,从而,抑制一些操纵子的转录。,cAMP在细胞中的增加对这些操纵子的转录是有利的。,CRP,（cAMP受体蛋白）也可称为代谢物激活蛋白,CAP，,是以二聚体形式存在的，,一个与DNA结合的domain,一个与cAMP结合的domain，,当CAP未与cAMP结合时它是没有活性的.,当葡萄糖缺乏时,，大肠杆菌细胞内cAMP水平上升，CRP结合到cAMP上。CRP-cAMP复合物可结合到,CAP结合位点（,紧邻RNA聚合酶结合位点上游，有一段序列与Plac部分重叠）。,cAMP-CAP与DNA相结合后，造成双螺旋弯曲，,与启动子上的RNA聚合酶接触,易于形成三元转录起始复合物，它还能直接影响RNA聚合酶的活性，,使转录效率提高50倍。,当葡萄糖存在时,，大肠杆菌不需要像乳糖这样的替代碳源。因此代谢操纵子如乳糖操纵子通常不被激活。原因是当葡萄糖存在时会降低cAMP合成酶的活性，细胞内cAMP的水平会降低，CRP自身不能独立与DNA结合，lac操纵子的结构基因表达下降。,乳糖操纵子小结,基因表达的外界信号,基因表达的,负调控,基因表达的,正调控,正、负调控协同表达,葡萄糖、乳糖浓度的变化,Lac,阻遏物,与操纵基因,cAMP+CAP,与相应的DNA序列,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；,若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖.,乳糖操纵子正性调节,I,P,O,Z Y A,CAP,site,CAP,cAMP,（四）乳糖操纵子的协调调节,CAP,低乳糖、低葡萄糖,I,P,O,Z Y A,site,cAMP,CAP,I,P,O,Z Y A,CAP,site,高乳糖、低葡萄糖,诱导物,I,P,O,Z Y A,阻遏蛋白,高葡萄糖、低乳糖,I,P,O,Z Y A,高葡萄糖、高乳糖,CAP,lac 操纵子小结,通常情况（葡萄糖供应正常）阻遏蛋白与操纵序列结合，基因不转录。,细胞外的乳糖通过透性酶吸收到细胞内；细胞内的-半乳糖苷酶将乳糖转变为异乳糖。异乳糖结合到乳糖阻抑物上使之从操纵序列上脱离，聚合酶迅速开始lacZYA基因的转录。这就是,负控诱导,。,然而，还需要细菌生长系统中缺少葡萄糖，使cAMP含量增加，才有足够量的cAMP与CRP结合形成CRP-cAMP复合物结合于Plac上游。使DNA双螺旋发生弯曲，转录才可以有效地进行。,若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,lac操纵子的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖，因为lac操纵子是弱启动子，还需要cAMP-CAP复合物的正控诱导。,1.什么是操纵子？乳糖操纵子的结构是,怎样的？,2.简述乳糖操纵子的负调控与正调控机制思考题,7.1.5.2.基因组成型突变,无乳糖或其他诱导物存在的情况下，半乳糖苷酶可持续合成，并不依赖于诱导物的存在.,I型组成型突变,I,+,合成特异的阻遏物，无诱导物时可阻止Z基因表达，诱导物可作为阻遏物的拮抗物，使阻遏物失活.,I,-,不产生活性阻遏物，因而无需诱,导物Z基因就可表达，阻遏物起负,调控作用.,I,+,对I,-,显性.,O型组成型突变：,野生型O,+,，突变型O,c,，,操纵基因的组成型突变,O,+,Z,+,-,O,c,Z,+,O,c,Z,+,/O,+,Z,+,O,c,Z,/O,Z,+,-,基 因 型,永久表达,说明：,O,c,对O,+,显性,.,7.3 色氨酸操纵子,trp operon),色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵子的调控。,由于,trp,体系参与生物合成而不是降解,，它不受,葡萄糖或cAMP-CRP的调控。,色氨酸的合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。,7.3.1色氨酸操纵子的结构,合成色氨酸所需要酶类的基因,E、D、C、B、A,等头尾相接串连排列组成结构基因群，受其上游的启动子Ptrp和操纵子o的调控，调控基因trpR的位置远离P-o-结构基因群，在其自身的启动子作用下，低水平表达分子量为47000的,调控蛋白R,。,另外，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa（不是trpA）。,trpR,阻遏蛋白,P,，-40+18,O,-21+1,L,+1+162,结构基因,t,A,下游,36bp,不依赖,p,t,t,下游,250bp,，,依赖,p,1.基因组成,R并没有与O结合的活性，当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与O特异性亲和结合，阻遏结构基因的转录。,这是一种,负性调控的、可阻遏,的操纵子，即这操纵元通常是开放转录的，当有效应物(,色氨酸为阻遏剂,)作用时，则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵元都属于这种类型，其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态。,7.3.,2.阻遏物对色氨酸操纵子的负调控,高Trp时,：辅阻遏物蛋白+Trp 结合操纵基因,不转录,低Trp时,：辅阻遏物蛋白 不结合操纵基因,转录,1trp操纵子的阻遏系统,trpR基因突变常引起trp mRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为,辅阻遏蛋白,(aporepressor)。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并使之关闭转录trp mRNA。,阻遏蛋白的结合位点,trpO,-21 +1，,反向重复序列,trpP,-40 +18,活性阻遏物与trpO 的结合与RNA pol与启动子的结合发生竞争,SNE299,阻遏系统,主管转录是否启动，,在,缺乏Trp时,，mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录,粗调开关,阻遏-操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关，相当于,粗调开关,，,主管转录是否启动,。trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行,细调控,，,指示已经启动的转录是否继续下去,。,这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，,由,色氨酸的浓度,来调节这种过早终止的频率。,7.3.3衰减作用对色氨酸操纵子的调控,前导区的序列特点,转录衰减机制,衰减机制的实验证据,1.前导区的特点,在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前有一个长,162bp,的mRNA片段被称为,前导区,，其中,123,150,位碱基序列如果缺失，,trp,基因表达可提高,6-10,倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样。研究发现，当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有,140个,核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录这就是,123,150,区序列缺失会提高,trp,基因表达的原因。,因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为,弱化子,(衰减子）。,研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎,-,环结构，有典型的终止子特点。,前导肽：,前导RNA序列中含有一个有效的,核糖体结合位点,（RBS）序列，并能形成由前导RNA 2768号碱基所编码的14个氨基酸的前导肽。该多肽有一个特征，其第10位和11位有相邻的两个色氨酸密码子。,在此开放阅读框前有,核糖体识别结合位点，,提示这段短开放阅读框在转录后是能被翻译的。,正是这两个相连的色氨酸密码子调控了蛋白质的合成。,色氨酸是稀有氨基酸，通常两个色氨酸密码子连续出现的可能性很小，在色氨酸含量很低的情况下核糖体将会在这个位点停滞。,前导肽的作用,就是决定色氨酸的含量并控制转录的终止。,前导区,有四个富含GC的区段，相邻的区段之间可形成,茎环结构,。,色氨酸前导肽编码序列的3端与互补序列1重叠，两个色氨酸密码子都在序列1内，终止密码子在序列1和2之间。,称为序列1、2、3和4。,弱化子发夹结构是序列3和4配对的产物(3:4结构),。序列1和2也是互补的，能形成另一个发夹结构1:2。然而序列2还和序列3互补。如果序列2和3形成2:3发夹结构，3:4弱化子发夹结构就不能形成，转录就不会终止。,序列分析发现，其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构,Terminator,由于色氨酸(色氨酸操纵子合成的酶的最终产物)是翻译过程中所必需的，因此细胞对它的含量很敏感，它决定了在mRNA中终止子(3:4)发夹结构是否形成。,在正常情况下，1:2和3:4发夹结构的形成在能量上是有利的。,弱化子,：一段位于结构基因上游前导区具有,终止子结构,的短序列，通过前导序列转录产生的 mRNA 形成类似于终止子的二级结构，达到转录终止的目的。,在色氨酸操纵子转录进行的过程中，RNA聚合酶在,序列2的末端停滞,直到核糖体开始翻译前导肽（即当前导肽开始翻译时，RNA聚合酶才又继续沿DNA模板链前进合成RNA）。,在,色氨酸含量高,的情况下，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，这样翻译可直达前肽导末端，封闭了序列2，使2-3区不能配对，当RNA聚合酶把3区和4区转录出来时，3:4发夹得以形成，转录被终止，trp操纵子被关闭。这一过程被称,为,弱化作用,。,高Trp时：,Trp-tRNA,Trp,存在,核糖体通过片段1(2个,Trp密码子),封闭片段2,片段3，4形成发夹结构,类似于不依赖因子的转录终止序列,RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物,转录、翻译偶联,产生前导肽,I,P 0,色氨酸水平高时,色氨酸缺乏时,，,负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这使得序列2能自由地与序列3形成发夹结构，而不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。,终止子(3:4)发夹结构不能形成，转录继续到trpE及其下游。,终产物,色氨酸含量的高低,决定了转录是提早终止(弱化)，还是继续转录完整个操纵子。,低Trp时,：,Trp-tRNA,Trp,没有供应,核糖体翻译停止在片段1,（2个,Trp密码子）,片段2，3,形成发夹结构,转录不终止,RNA聚合酶继续转录,P 0,I,色氨酸水平低时,转录衰减机制,I,P 0,前导区,P 0,前导区,trp,1 2 3 4,UUUU,2,3,3,4,P 0,前导区,衰减子,mRNA,1 2,trp,trp,3,4,UUUU,P 0,前导区,mRNA,1,trp,4,2,3,Trp,结构基因,UUUU3,UUUU,UUUU,调节区,结构基因,trpR,O,P,前导序列,衰减子区域,UUUU,前导,mRNA,1,2,3,4,衰减子结构,第10、11密码子为trp密码子,终止密码子,14aa前导肽编码区,:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱：,序列1/2序列2/3序列3/4,trp,密码子,UUUU,7.3.5 阻遏作用与弱化作用的协调,弱化作用,trp存在时，约有10的RNA pol,侥幸转录,-trp,活性阻遏物 ,无活性阻遏物,+trp,Negativerepressible operon,可以被最终合成产物所阻遏,R,P,O,leading seq.E D C B A,trp,+,为什么需要阻遏体系？,当大量Trp 存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导mRNA合成。,经济,仅有少量 trp时，RNApol启动，,但在L.S.处脱落，转录中断,R,P,O,leading seq.E D C B A,少量trp,+,不足以结合,O,位点,为什么需要弱化系统？,当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp 合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。,Trp操纵子是一种阻遏型操纵子。,第一结构基因和启动子之间有一个前导区。,前导区序列1、2、3、4组成。序列1中有两个色氨酸操纵子。序列3和序列4可形成不依赖rho因子的终止结构-衰减子。,转录衰减是转录过程与前导肽翻译过程的偶联。,弱化的重要性,依靠弱化作用，色氨酸的存在就使色氨酸操纵子的转录被抑制了,10倍,。与色氨酸阻抑物的作用(,70倍,)合在一起，这就意味着色氨酸水平对色氨酸操纵子的表达施加了,700倍,的调节效果。,两个调控系统，避免浪费提高效率,阻遏系统：,高水平trp时，不转录,低水平trp时，转录至LS,弱化系统：细调,原核生物细致的精细调控机制,增强原核生物对环境的适应性,7.4.半乳糖操纵子,(gal operon),前言,半乳糖,(gal),也是被细菌用作碳源的一个糖类，细菌体内存在的调控半乳糖代谢的结构单元,半乳糖操纵子。,galR,P,O,galE,galT,galK,DNA,调节基因,启动基因,操纵基因,半乳糖激酶,半乳糖转移酶,半乳糖异构酶,RNA聚合酶结合位点,O,CAP结合位点,1.结构基因,:,galE、T、K,细胞代谢半乳糖需要三种酶:,半乳糖异构酶,(UDP-gal4epimerase galE),半乳糖转移酶,(gal transferase,galT),半乳糖激酶,(galk inase galK),7.4.1.半乳糖操纵子的结构特点,半乳糖+ATP,半乳糖-1-P+ADP+H,+,半乳糖-1-P+UDPGlu UDPGal+,G-1-P,UDPGal UDPGlu +ADP+H,+,半乳糖激酶,半乳糖转移酶,半乳糖异构酶,三个酶的作用是使半乳糖转变成,葡萄糖-1-磷酸(G-1-P),总反应式为：,半乳糖+ATP G-1-P+ADP+H,+,三个酶,2.调节基因:,galR,galR与结构基因galE、T、K及操纵区O等离得很远，并不相邻，这是gal操纵子与lac操纵子的一个区别。,galR产生的阻遏蛋白对galO的作用与lacI-lacO的作用相同,galR,和galO,c,都造成组成型表达。,gal操纵子与lac操纵子一样都是,可阻遏、也是可诱导的操纵子,，只是gal操纵子诱导物是,gal,，而lac操纵子的诱导物则是其分解物,异乳糖,。,3.双操纵区（O区）,Gal操纵子,外操纵区,：在P区上游-67-53.,内操纵区,：在结构基因galE内部.,两操纵区的顺序很相似，只有个别碱基不同，推测两操纵区相互作用，,强化了阻遏作用。,半乳糖操纵子及其调控区的碱基序列,4.双启动子,其mRNA可从两个不同的起始点开,始转录。,半乳糖操纵子及其调控区的碱基序列,分离到一些突变株，其中一类突变株能在,不含葡萄糖,的培养基中高水平合成半乳糖代谢的三种酶。另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于,葡萄糖,，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达，不合成半乳糖代谢酶。,分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅,5bp,的启动子，可以分别起始mRNA的合成，命名为,PG,1,和,PG,2,。,每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点(-10区）S1和S2。,gal操纵子,半乳糖操纵子及其调控区的碱基序列,从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要,半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。,两种突变体：cya-（cAMP酶突变）,cap-或crp-（cAMP受体蛋白或CAP突变）,不能从S1转录。,说明：,G不存在时，cAMP-CAP激活,从S1的转录。,从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖的存在，高浓度的cAMP-CAP反而抑制由PG2启动子起始的转录。,因为gal操纵子有两个启动子，因此，,G的存在,并不能抑制gal基因的表达，只有：,PG1,突变而,G,不存在时,或,PG2,突变而,G,存在时，,才能阻止gal基因的表达。,7.4.2.cAMP-CAP对双启动子的不同作用,1.体外转录实验,用含半乳糖操纵子调节区的限制性酶片断作模板转录，起始可以从S1、S2两个位点开始。,加入cAMP-CAP时，从S1开始转录。,无cAMP-CAP时，从S2开始转录。,体外转录说明,：,cAMP-CAP激活了从S1的转录，却抑制了从S2的转录。,激活S1的转录是通过降低双螺旋的稳定性促进开放启动子复合物的形成。,同时由于PG2离CAP结合位点较近，复合物与CAP的结合，在空间位置上妨碍了RNA聚合酶与PG2的,结合，从而抑制了从S2的转录。,2.突变实验,发现一gal启动子突变株不能利用gal，将这个突变株再进行一次突变为cya-、cap-或crp-，就可以利用gal了。,合理的解释是,：,开始的突变型，不能从S1转录，能从S2转录，由于细胞内存在,cAMP-CAP,又抑制了从S2的转录，因而不能利用gal。,第二次突变为cya-、cap-或crp-，使得cA