基因组测序原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因组测序原理,第一代测序技术,第二,代测序技术,第,三代测序技术,第一代测序技术,1,、化学降解法,在该方法中,一个末端被放射性标记的,DN A,片段在,5,组互相独立的化学应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成,5,组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的,DN A,分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原,D NA,片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。,准确性好，易掌握，但操作麻烦,3,、荧光自动测序技术,荧光自动测序技术基于,Sanger,原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了,D NA,测序的速度和准确性。,4,、杂交测序技术,不同于化学降解法和,Sanger,法,而是利用,DN A,杂交原理,将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上,把待测的,DN A,样品片段变性后与其杂交,根据杂交情况排列出样品的序列信息。该方法检测速度快，但误差较大，且不能重复测定。,第二代测序技术（合成测序）,第二代测序流程：,1,、,454,测序技术：,使用的是,焦磷酸测序技术,。首先将基因组分割为长度为,300,到,500,个碱基对的片段,然后将双链解开,弃去互补链当中的一条,将另一条链与连接在塑料小珠上的复合物结合,并使得每个珠子只与一条链发生结合。随后,PCR,对结合在小珠上的片段进行复制,直到各个片段的拷贝完全覆盖其所在的小珠为止。接下来将珠子分散在一个包含大约,160,万个小孔的平板 上,并加入一系列的测序试剂和核苷酸。每当一个核苷酸被添加到正在延伸的,D N A,链当中时,该反应会释放一个焦磷酸,(PP i),分子,随即在,ATP,硫酸化酶的催化下与腺苷酰硫酸反应生成,AT P,在位于小孔中的荧光素酶催化下该,ATP,被用于促进,D-,虫萤光素发光。用,CCD,将每个微球发出光及其强度进行同时成像,并将所记录下的发光现象与当时加入的核苷酸相关联,可以得到同时发生的几十万个,DNA,片段的延伸情况。,第二代测序技术原理,2,、,Solexa,测序法：,使用的方法是,克隆单分子阵列技术,，将待测序的单个基因组,D N A,片段固定在载玻片表面不同的位置上随后,对这些单个的,D N A,片段同时进行复制,生成大量微小的,D N A,簇,(D N A cluster),。最后,在与,Sanger,测序方法类似的步骤中,分别采用,4,种不同颜色荧光基团标记的,4,种核苷酸单体,以及标准的微阵列光学检测系统,同时检测阵列中那些被固定,D N A,链上的引物延伸过程。,Solexa,的测序技术可以同时分析数亿个单个,D N A,单链分子的序列,从而能够对个体进行完整的基因分型,3,、,ABI/SOLID,连接酶测序技术：,也被称作为连接测序,(sequenceing byligation),。在该方法中,DNA,片段文库生成以后,首先将短的,DNA,片段固定在微珠上,并通过乳液,PCR,进行扩增,;,然后将含有扩增后片段的微珠以阵列的方式排布,再加入测序引物,与固定在每个微珠上的,DNA,片段中已知的起始序列发生结合。随后,向混合物中加入长度为,8,个碱基的荧光标记寡核苷酸探针。这些探针从,3,端开始的第,5,个碱基为查询碱基,分别用,4,种不同的荧光标记表示,A,、,G,、,T,或者,C,共分为,4,组。如果一条带有正确互补序列的探针与DNA,发生结合,DNA,连接酶将把它与测序引物进行连接,使得它被固定在表面上,而其他结合得不够牢固的探针分子都会被洗去。接着,用激光来激发探针上的荧光标记分子,从而获得新结合上碱基的信息。最后,将探针剩余部分和荧光标记切除。在新一轮的测序过程开始时,重复连接、荧光检测和切除步骤,得到第,10,个碱基的信息。类似地,在第三轮中可以获取第,15,个碱基,第四轮中获取第,20,个碱基,依此类推。,4,、,Ion Torrent,测序技术,原理：,利用每个碱基在聚合反应中都会产生一个质子，从而改变了测序池体中的,pH,值，而,pH,值变化则通过设置于每个池体底部的由集成电路构成专一的,pH,值传感器进行检测,。,优点：,无以伦比的快速、简捷易用的技术、强大的扩展性,第三代测序技术（直接测序）,1,、,Helicos,单分子测序技术：,原理,:,利用合成测序理论，将样本,DNA,的单链分子绑定在该仪器特有的没有背景荧光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会特异性结合到,DNA,分子的结合位点上 通过激光激发结合在,DNA,子上的荧光标记的核苷酸，从而使标记物发出荧光，相机以,15ms,速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到,DNA,片段上的荧光碱基 之后，结合的核苷酸会被移除，然后，进入下一次结合。,优缺点,：不需要,PC,扩增，所以能反映样本的真实情况，通量也较高，但由于该技术限制可读的,DNA,片段长度平均仅为,32bp,，而且其高度精密的显微镜不仅造成其仪器庞大价格昂贵，而且对环境要求高升级困难。,2,、,Nanopores,新型纳米孔测序技术：,原理,：单链,DNA,分子在电场作用下，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，使得单个碱基与纳米孔内的环糊精作用，检测碱基通过纳米孔时的电流变化来实现测序。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。,优点,：纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，测序的准确度 可达,99.8%,以上，对于长达,1000bp,的单链,DNA,分子、,RNA,分子或者更短的核酸分子而言，无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜快速地进行,DNA,测序成为可能。,三代测速技术的比较,第一代测序技术：,凭借其长的序列片段和高的准确率,适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期,GAP,填补,但是成本昂贵,而且难以胜任微量,DNA,样品的测序工作。,第二代测序技术：,454,适合对未知基因组从头测序,搭建主体结构,但在判断连续单碱基重复区时准确度不高。,Solexa,具有通量高、片段短、价位低的特点,适合于小片段如,miRNA,的研究。,SOLID,具有双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量,但无法在基因组拼接中的广泛应用。,第三代测序技术：快速，直接测序，简洁易用，具有强大的扩展性。,三代测序技术的比较,基因组测序的应用与实践,DNA,水平的应用：,1,、全基因组的测序,2,、基因组重测序,3,、宏基因组研究,RNA,水平的应用：,1,、转录组测序,2,、小分子,RN A,测序,表观基因组学应用：,1,、转录因子结合位点测序,2,、,DNA,甲基化测序,参考文献：,岳桂东,高强 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用 生命科学,2012,年第,42,卷,陈 勇,柳亦松,曾建国,，,植物基因组测序的研究进展 生命科学研究,2014.2,杨晓玲 施苏华 唐恬新一代测序技术的发展及应用前景 生物技术通报,2010,年第,10,期,周晓光 任鲁风,李运涛,张猛,俞育德,于军 下一代测序技术,:,技术回顾与展望 生命科学,2010,年第,40,卷,陆祖宏 吕华 肖鹏峰，白云飞快速低成本全基因组,D N A,测序技术 中国生物工程医学学报,2008.4,The End,