外源基因表达调控1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,起始密码边周序列（,initial code）,翻译增强因子（,）,密码剂量效应(,codon bias),启动子活性（,promoter）,增强子（,enhancer）,Poly(A),信号(,signal),内含子（,intron）,不稳定因子,隐含内含子序列,隐含,Poly(A),信号,外源基因在不同水平上的表达调控,整合状态,基因活性,调控水平,DNA,水平,RNA,水平,蛋白质水平,转录效率,转录加工,mRNA,稳定性,翻译效率,翻译后修饰,蛋白质运输,整合位置效应（,position effect）,拷贝数影响（,copies numbers）,DNA,再分布（,DNA rearrange）,DNA,甲基化（,DNA methylation）,共抑制和反式失活（,cosuppression&trans-inactivity,）,剪切,内含子-1,叶绿体,线粒体,核,糖基化,信号肽,第三部分 外源基因在转基因植物细胞内的表达调控,一.转化外源基因的瞬时表达和稳定表达,1.瞬时表达,概念 过程,2.瞬时表达的机理,a.,瞬时表达是没有整合的外源基因的表达,b.,瞬时表达是一种正常的表达方式,3.,外源基因瞬时表达的影响因素,（1）质粒,DNA,的结构,（2）内源核酸酶的影响,（3）受体细胞生理状态,(4)内源,GUS,酶抑制剂,4.外源基因瞬时表达的应用,（1）在基因转化研究中的应用,a.,农杆菌转化能力的检测,b.,优化基因转化条件,（2）植物基因表达调控的研究,5.外源基因的稳定表达,外源基因在植物细胞中的稳定表达的条件,a.,时间长,b.,无迅速衰退现象,c.,分子杂交证明,DNA,已经整合到植物基因组中,d.,能遗传，并符合分离规律,二.转化外源基因的同源性和异源性表达,2.,原核生物基因在植物细胞中的表达,原核与真核基因在表达机制上有很大的差异，因此细菌的基因直接导入植物细胞是不能表达的。即使采用了植物基因的表达调控系统，没有改造的细菌基因也只能很低水平的表达。,例Bt.,-,毒蛋白抗虫基因 表达量仅占植物可溶蛋白总量的0.001%达不到抗虫的目的。原因是，,mRNA,结构中可能隐含有,poly A,信号,AAUAA,序列及内含子切割序列等，从而造成,mRNA,在不适当的位置上断裂而降解。,向植物中引入,Bt,基因的改造。在不改变氨基酸序列的情况下，改变了20%的碱基序列，提高了,GC,含量，使其在植物中的表达由原来的0.001%提高到0.050.1%（提高了50-100倍）。抗虫效果明显提高。,向植物中引入,Bt,基因的改造修饰原则：,1.优先使用植物偏爱的密码子,2.改变基因的,GC,含量（3645%），使之与植物基因,GC,含量一致,3.注意,XCG/XCC,和,XTA/XTT,的比值。对植物而言，该比值低好。,Thr,Pro,Ala,和,Ser,密码子第三位避免用,G。,4.翻译起始区第4个核苷酸用,G，,以符合,ATG GC,的要求。,5.去除隐含的,poly（A）,信号。如：,AATAA，AATGAA，AATAAT，AATATT，GATAAA，GATAAG,6.,去除隐含的,RNA,聚合酶,II,终止序列。,CAN,19,AGTNNAA,7.清除发夹环结构。,CUUCGG,8.,消除隐含的内含子剪切序列。,AAG.GTAAGT,等,三.转录调控序列对外源基因表达的影响,1.高等植物基因的分子结构特点 (图,),9,三.转录调控序列对外源基因表达的影响,1.高等植物基因的分子结构特点,2.5-,端表达调控序列的基本特征,启动子,Promoter,增强子,Enhancer,沉默子,Silencer,顺式作用元件,Cis-acting-element,反式作用因子,Trans-acting-factor,启动子确保转录精确而有效地起始的,DNA,序列,TATA box 25-35,负责转录起始的精确性,CAAT box,GC box 80-110,控制转录起始频率,多数组成型启动子上游有（,hexamer motif)TGACTG,可诱导启动子中常有,CCACGTGG 8,核苷酸,G-box,植物转录起始位点处的保守序列YYY A YYA,+1,三.转录调控序列对外源基因表达的影响,3.,启动子和增强子,增强子的作用是增强,RNA,的转录效率，其功能是通过结合特定的转录因子或影响,DNA,的构象而实现的。,增强子作用的三个特点：,1.它与启动子的相对位置和取向无关，具有远程效应,2.需要特定的蛋白质因子的参与,3.有些（如,SV40,的增强子)能在几乎所有类型细胞中发挥 作用，而大多数具有相对的组织特异性,目前已分离的大量的启动子（包括增强子）按其作用方式大体可划分为三类 组成型,诱导型,组织特异型,三.转录调控序列对外源基因表达的影响,3.,启动子和增强子,（1）,组成型启动子,A.,CaMV 35S,启动子,CaMV 35S,启动子,二.转录调控序列对外源基因表达的影响,3.,启动子和增强子,（1）,组成型启动子,A.,CaMV 35S,启动子,B.NOS,启动子,组成型,损伤,激素诱导活性,-123-114之间或重叠区有20,nt Z-DNA,形成因子可以与,bZIP,蛋白因子相互作用,诱导活性必需序列.,启动子的强度依组织部位及器官位置而变化,老组织中强,生殖器官中随发育状态而不同.在禾本科植物中完全或几乎无启动子表达能力.,TGACGT,AAGCACAT,ACGTCA,-123114 Z-DNA,三.转录调控序列对外源基因表达的影响,3.,启动子和增强子,（1）,组成型启动子,35,S P -75 0,TGACGT,Protein-leucine zipper(trans-acting factor),NOS P,fgfh,cdgfg,hjkhhjh,二.转录调控序列对外源基因表达的影响,3.,启动子和增强子,（1）,组成型启动子,A.,CaMV 35S,启动子,B.NOS,启动子,C,.,玉米的,Ubiquitin,和水稻,Actin1,启动子,同一启动子在不同的受体细胞内的调控表达水平的能力有很大差别,如35,S,启动子在禾本科中是双子叶植物的1-10%.,NOS,启动子在禾本科植物细胞内几乎没有活性,根据试验目的,往往需要外源基因以不同的强度表达.,组成型启动子,不同启动子的相对强度(2-,Npt-II,活性为100,pGVLl150,为对照),嵌 合 基 因 结 构,启动子来源,水稻悬浮系,水稻叶,烟草叶,2-,Npt-II,T-DNA,100,100,100,35,S-Npt-II,CaMV,404,ND,28 1,Nos-Npt-II,T-DNA,11 2,8 2,1.2 1,1-,Npt-II,T-DNA,10 2,ND,9 2,Z4-Npt-II,Zein 4 gene,0.4 0.1,0.4 0.1,0.4 0.1,4,7-,Npt-II,rice,0.2 0.1,0.2 0.1,0.2 0.1,pGVL150,_,0,0,0,