分子生物学常用技术原理课件.ppt

Genetic engineering,你,们,第三级,第四级,第五级,*,相关概念,DNA克隆,工具酶,目的基因,基因载体,基本原理,重组DNA技术应用,本节主要内容,一、基因工程的基本概念,克隆(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，即无性繁殖。,技术水平：分子克隆(molecular clone),即DNA 克隆,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的,分离获得某一感兴趣的基因或DNA,获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering)利用基因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物个体的特征及相关的工作称基因工程，,二,、,工具酶,限制性核酸内切酶,DNA聚合酶,逆转录酶,T4DNA连接酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA聚合酶,多核甘酸激酶等,重组DNA技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割DNA,DNA连接酶,催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,DNA聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow片段,又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA第二链合成，双链DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在3羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,（一）限制性核酸内切酶,1、概念,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,GGATCC,CCTAGGG,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome,),切口：平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,3、限制性核酸内切酶的识别和切割位点,分为I,和II类限制性内切酶.重组DNA主要用II类酶,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,（1）、产生5突出粘性末端，以EcoRI为例,5 G AATTC.3,3 CTTAA G.5,5G AATTC.3,3CTTAA G5,(2)、产生3突出粘性末端，以Pst为例,5CTGCA G 3,3 G ACGTC5,5CTGCA G3,3G ACGTC5,(3)、产生平端：如前图,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,*分类,、,（基因工程技术中常用型）,（二）、其它工具酶,1、DNA连接酶,2、DNA聚合酶,、,（1）、DNA聚合酶的性质；（2）、DNA聚合酶的主要用途,3、逆转录酶,4、多核苷酸激酶,5、硷性磷酸酶,6、末端脱氧核苷酸转移酶,三、载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体,质粒DNA,噬菌体DNA,病毒DNA,粘粒DNA,克隆载体cloning vector),为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expression vector),为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,三、载体,此处是标题,wang,home,表 达 载 体,载体的选择标准,能自主复制；,具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；,有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,分子量小，以容纳较大的外源DNA。,（一）、质粒,(plasmid),特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,噬菌体DNA改造系统,gt系列（插入型，适用cDNA克隆）,EMBL系列（置换型，适用基因组克隆,）,（二）,.噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）,M13mp系列,pUC系列,（三）粘性质粒(cosmid),其它：如,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),（四）、病毒,用动物病毒DNA改造的载体,（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,重组DNA,(,recombinant DNA,)-分子克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆),。,四、重组,DNA,技术的基本原理,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,目 录,五、重组DNA技术的基本过程,（一）目的基因的制备,1.化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,2.基因组DNA文库(genomic DNA library),3.cDNA文库(cDNA library),4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体DNA,限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA 片段,cos L,R cos,20 Kb 外源 DNA 片段,基因文库,目 录,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,*从cDNA文库获取目的基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,目 录,（二）目的基因与载体的连接,1.粘性末端连接,方式：(1)同一限制酶切位点连接,(2)不同限制酶切位点连接,Bam,H切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体DNA用,Bam,H切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,目 录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco,R切割位点,Bg,l切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目 录,2.同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,3.平端连接,适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,目 录,5,3,3,5,载体DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA连接酶,15,C,重组体,目 录,4.人工接头,(linker),连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接,。,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,受体菌条件,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态(competent),导入方式,转化(transformation),转染(transfection),感染(infection),（三）重组DNA导入受体菌,（四）重组体的筛选和鉴定,1.,直接选择法,(1)抗药性标记选择（遗传学方法）,(2)标志补救(marker rescue),(3)分子杂交法,原位杂交,Southern印迹,2.免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,3.基因重组与表达技术,基因来源:,酶切片段,mRNA,cDNA,(RT-PCR),PCR,产物,化学合成：单链寡核苷酸,互补寡核苷酸链退火时,注意温度变化要非常的缓慢,有利,于寡核苷链完全正确互补成双链,(95,自然冷却至室温,),克隆重组,克隆载体的选择,抗生素双抗性载体：,pBR322(amp+,tet+),互补筛选:pUC19 pBluecript II,基因与载体的连接,外源片段与载体的比例：平端(3-10):1，粘端 1:1,转化宿主:JM109 DH5,TG1(competent cell),重组子的筛选与鉴定,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,重组子的筛选与鉴定,（-半乳糖苷酶）,lacZ,Am,N,2,H,N片段,COOH,C,片段,宿主菌,重组子的筛选与鉴定蓝白筛选,原理,X-gal,Lac Z,蓝色化合物,重组子,原理,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,蓝白斑筛选,互补：,laz,编码的肽链,；,半乳糖苷酶突变体,-,互补（,-complementation,）：,在T-vector或,PUC,质粒序列中，插入了,lac,启动子,-,操纵子基因序列以及编码,-,半乳糖苷酶,N-,端,145,个氨基酸的核苷酸序列（又称,-,肽这类载体对应的宿主菌（如,JM,、,DH5,系列）,-,半乳糖苷酶基因失去了编码,-,肽碱基序列,只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的,-,半乳糖苷酶,N-,端片端才能与宿主菌的缺陷,-,半乳糖苷酶互补，产生有活性的,-,半乳糖苷酶，这种作用称为,-,互补。,重组子鉴定,挑分离良好，大小中等的菌落培养5ml菌液,小量制备质粒,酶切，琼脂糖凝胶电泳,测序,基因表达,选择表达系统,原核系统 真核酵母 动物细胞 植物细胞,构建表达载体,重组克隆载体 表达载体,目的基因亚克隆,正确的ORF,导入细胞:,化学方法（CaCl2)、电转化、显微注射、基因枪,外源基因表达:,化学诱导、温度诱导,基因表达检测:,SDS-PAGE、RT-PCR、Western Blot,亚克隆,一、定义,将克隆DNA片段从一个载体转移到另一个载体,二、应用,研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆,DNA片段的表达,(插入失活法),抗药性标记选择,目 录,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补,目 录,互补的检测,目 录,原位杂交,目 录,Southern印迹,目 录,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,限制酶消化,开环载体DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,目 录,表达体系的建立,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（五）克隆基因的表达,1.原核表达体系,（,E.coli表达体系最为常用）,标准：,选择标志强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli表达体系的不足,不宜表达真核基因组DNA,不能加工表达的真核蛋白质,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原cDNA,的表达和分泌,目 录,优点：,可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.真核表达体系,酵母、昆虫、乳类动物细胞,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,目 录,目 录,重组DNA医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子VIII,促进凝血,颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗(CHO,酵母),预防乙肝,口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,基因诊断,(genetic diagnosis),是,利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准,.能正确扩增靶基因；,.能准确区分单个碱基的差别；,.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;,.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查,。,（四）基因治疗,定义,基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗(germ line gene therapy),分子生物学常用技术,凝胶电泳(,),分子杂交(,),聚合酶链反应,(PCR),技术(,),DNA,的物理图谱,DNA,序列测定,基因芯片,第一节 凝胶电泳,(gel electrophoresis),电泳概念,基本原理,Q,6,r,:迁移率,Q,:,电荷量,r:,粒子半径（分子量）:介质粘度,电泳的用途,分离,鉴定纯度,测定分子量,凝胶电泳的种类,琼脂糖凝胶电泳(,),聚丙烯酰胺凝胶电泳,（一）,分离核酸原理,电荷效应,分子筛效应,分子构象,琼脂糖凝胶电泳,(agarose gel electrophoresis),分离核酸原理,操作要点,应用范围,1.电荷效应,核酸是,两性电解质,pH=,3.5,正电荷,pH=8.0,8.3,负电荷，正极,2.分子筛效应,小分子,移动快,，大分子移动慢,3.分子构象,闭环超螺旋,线状,DNA,开环,DNA,+,-,（二）操作要点,支持物,凝胶浓度的选择,DNA,分子量标准,电泳缓冲液,样品制备,电泳条件,DNA电泳染色,DNA,片段的回收,1.支持物,商品化的琼脂糖,琼脂糖种类,普通,低熔点,高纯,高筛分,熔点,8090,100ng,上样缓冲液,50%甘油/蔗糖,0.5%溴酚蓝/二甲苯青,点 样,6.电泳条件,潜水电泳,恒压电泳,低压:12V/cm,中压:810V/cm,高压：几十V/cm,温度：,1525,潜水电泳,7.电泳染色,溴乙锭,(ethidium bromide,EB,),结构及染色原理,染色方法,加入凝胶液中,电泳结束后,染色,EB染色原理,紫外灯下显色,8.DNA片段的回收,低熔点琼脂糖法,透析袋电洗脱法,(5kb),DEAE纤维素膜法(0.55kb),（三）应用范围,DNA,的分离、纯化和鉴定,限制性酶切图谱分析,重组体的分离、鉴定,杂交分析,PCR,产物的分离鉴定,第二节 分子杂交,分子杂交的基本原理,固相支持物,探针,几种常用杂交技术,一、分子杂交的基本原理,核酸的变性和复性,核酸分子杂交,(nucleic acid hybridization),在,DNA,复性过程中，如果把不同,DNA,单链分子放在同一溶液中，或把,DNA,与,RNA,放在一起，只要在,DNA,或,RNA,的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链,(,heteroduplex,),。,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,杂交条件,靶分子-支持物,探针,杂交袋,杂交炉,杂交种类,被检核酸种类和方法,原位杂交,斑点杂交,Southern杂交,Northern杂交,Western杂交,反应介质,液相杂交,固相杂交,(,),二、固相支持物,硝酸纤维素滤膜,(nitrocellulose filter membrane),尼龙膜(nylon membrane),1.,硝酸纤维素滤膜,特点,吸附ss,DNA,和,RNA,本底低,不足,不适于重复杂交,滤膜较脆,不适于电转移法,对,DNA,小片段(,缺口翻译,操作简便,DNA/cDNA 探针,DNA的5末端标记(5end labeling),碱性磷酸酶T,4,多核苷酸激酶,标记原理,制备寡核苷酸探针,制备短的DNA/RNA探针,（一）印迹技术,利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到,NC,等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“,blotting,”，译为印迹技术。,用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“,探针,”，探针可以与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,（二）探针技术,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹,(Southern Blotting),（二）RNA印迹(Northern Blotting),（三）蛋白质的印迹,(Western Blotting),用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,3、应用：,（1）检测某一组织或细胞中已知的特异,mRNA的表达水平,（2）比较不同组织和细胞中的同一基因的,表达情况,（三）蛋白质印迹(Western Blot),1、概念：,蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。相对于DNA的Southern Blot和RNA的Southern Blot，蛋白质印迹被称为Western Blot。,2、基本过程：,(1)电泳（Electrophoresis）：,一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。,最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。,蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。,目前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。,(2)转膜(Transfer)：,(3)封闭(Blocking)：,封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。,现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛奶中可能含有要用Westem印迹法检测的蛋白质时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。,(4)一抗孵育(Primary antibody incubation)：,特异性抗体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分子结合.,(5)二抗孵育(Secondary antibody incubation)：,碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或放射性核素标记的二抗与之反应。二抗需根据一抗进行选择。,(6)显色：,用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度.,放射自显影照片,其他：,斑点印迹,(dot blotting),原位杂交,(in situ hybridization),DNA,点阵,(DNA array),DNA,芯片技术,(DNA chip),三种印迹技术的比较,分子杂交实验,放射自显影照片,DNA,点阵,核酸序列分析的基本原理：,化学裂解法,(,Maxam-Gillbert,法,),DNA,链的末端合成终止法,(Sanger,法,),第三节,核酸序列分析,Nucleic Acid Sequence Analysis,一、DNA链末端合成终止法,G,A,T,C,测序反应,电泳,AACGTGGACT,AACGTGGAC,AACGTGGA,AACGTGG,AACGTG,AACGT,AACG,AAC,AA,A,5,3,正极,负极,ddG,ddA,ddT,ddC,链末端合成终止法测定,DNA,序列的原理,二、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现,DNA,序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行,Sanger,测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小,DNA,片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定,DNA,碱基的排列顺序。,ddG,ddA,ddT,ddC,红色荧光,绿色荧光,黄色荧光,蓝色荧光,电泳,DNA,序列自动分析原理及结果图,四、Southern 杂交Southern blotting/DNA blotting,1975,年，,Edwen Southern,等,印迹,(blotting),:转移,blot:a spot or mark,esp.of ink,blotting,1.,印迹的方法,毛细管转移法,电转移法,真空转移法,毛细管转移法,电转移法,2.Southern 杂交的步骤,五、Northern 杂交,RNA blotting,步骤,总,RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色,应用,检测组织/细胞中mRNA的大小、量,比较不同组织/细胞中基因的表达情况,Northern 杂交,六、Western 杂交,免疫印迹immunoblotting),SDS-PAGE,转移蛋白第一抗体标记的第二抗体,(,探针,),检测,应用-蛋白质的定性定量分析,免疫印迹,Southern,Northern&Western,待测物质,支持物,探针,转移方式,Southern,DNA,NC,单链核酸,毛细管/电/真空,Northern,RNA,NC/尼龙,单链核酸,毛细管/电/真空,Western,蛋白质,NC/PVDF,抗体,电转移,第二节,聚合酶链反应,Polymerase Chain Reaction,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,一、,PCR,技术的工作原理,5,5,5,5,5,5,5,5,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,PCR,体系基本组成成分,PCR,的基本反应步骤,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,第三节 PCR技术,聚合酶链式反应,(polymerase chain reaction,PCR),PCR的基本原理和步骤,PCR的影响因素,一、PCR的基本原理和步骤,基本原理DNA复制,三个步骤,变性,(denaturation),退火(,annealing),延伸,(extension),标准的PCR反应体系,10X 扩增缓冲液：10ul,模板DNA:0.12ug,引物：各0.21umol/L,4种dNTP:各200umol/L,Mg,2+,:1.5mmol/L,Taq DNA聚合酶：2.5U,总体积：100ul,二、PCR的影响因素,模板 pg-ug,引物 0.1-0.5uM,Taq DNA,聚合酶,1-5U,4种,dNTP 20-200uM,Mg,2+,1.5-2.5mM,过高,:,非特异扩增,过低,:反应产物减少,循环条件,25-35,引物,长度：,15,30nt,G+C,含量：,4060%碱基的随机分布,避免引物自身和引物之间的互补,引物的,3,端,引物的,5,端,引物浓度：,0.21umol/L,自动搜索：Primer Premier 5.0,在线设计：frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi,分析评价：Oligo 6.0,循环条件,变性温度和时间,:,9096,3060s,退火温度和时间,:4060,3060s,Tm=4(G+C)+2(A+T),延伸温度和时间,70,75,(72),1kb,1min;,34kb,34min,;,10kb,15min,循环次数:2535,次,聚合酶链,式,反应,1.Denaturation,2.Annealing,3.Extension,PCR.EXE,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。,Essential Components,of,PCR Reaction,salts(ions),dNTPs,Primers,DNA Polymerase,Template DNA,利用特异性引物以,cDNA,或基因组,DNA,为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的,mRNA,为模板获得目的片段；,利用简并引物从,cDNA,文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；,利用随机引物从,cDNA,文库或基因组文库中克隆基因。,二、,PCR技术,的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用,PCR,技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突变,将,PCR,技术引入,DNA,序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；,待测,DNA,片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。,PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,（四）DNA序列测定,（五）基因突变分析,逆转录,PCR(reverse,transcription PCR,，,RT-PCR),是将,RNA,的逆转录反应和,PCR,反应联合应用的一种技术。,RT-PCR,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的,RNA,进行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆转录PCR技术,三、几种重要的,PCR衍生技术,原位,PCR(in,situ PCR),是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的,PCR,反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测,DNA,或,RNA,是否在该组织或细胞中存在。,原位,PCR,方法弥补了,PCR,技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。,（二）原位PCR技术,荧光定量PCR技术,原理,荧光探针：(1)Molecular Beacon,(2)TaqMan,Molecular Beacon,Q淬灭,R 发光,特异性荧光双标记探针,Taq,酶,53,外切酶活性,(2)TaqMan,R,Q,5,3,5,3,5,3,5,3,Excitation,R,Q,Q,R,Q,R,Excitation,双标记探针（Taqman Probe）,C,T,值,定量:通过外标准来定量未知样品,样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数,Ct值重复性好,只与样品的拷贝数有关,通过已知标准品,建立Ct值与拷贝数的标准曲线,标准品制备,1、标准菌,2、构建质粒,3、化学合成基因片段,标准品的定量,1、标准菌：拷贝数已知,（卫生部）,2、,无限梯度稀释,：,高浓度按10倍浓度梯度逐渐稀释,10,n,10,n-1,10,1,0,荧光定量,PCR,设计流程,靶基的选择,设计引物与探针,制作标准曲线,预实验：特异性敏感性,（三）实时PCR技术,实时,PCR(real-time PCR),技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量,PCR,。,实时,PCR,技术原理,Q,R,3,3,5,5,上游引物,下游引物,荧光标记引物,R,Q,3,3,5,5,基因克隆技术,c差示分析法,大规模克隆技术,gene map-based cloning,RACE(rapid amplification of cDNA)技术,可以扩增缺失的DNA序列。,可以完成3和5的未知序列的扩增。,5扩增,3扩增,文库的构建与筛选,文库,c文库,筛选方法,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),cDNA,文库,(,cDNA,library),基因文库,(,gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,一、基因组,DNA,文库,基因组DNA文库是指生物的,基因组,DNA,的信息（包括所有的编码区和非编码区）以,DNA,片段形式贮存的克隆群体。,用于构建基因组文库的载体有,噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。,基因组文库和,cDNA,文库的构建和筛选,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,cDNA,文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的,cDNA,序列,的克隆群体，它以,cDNA,片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。,二、,cDNA,文库,第五节,生物芯片技术,Biological Chip Technique,是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作,DNA,微阵列,(DNA microarray),。,一、基因芯片,基因芯片,(gene chip),基因芯片工作流程示意图,基因芯片的种类,表达谱基因芯片,诊断芯片,检测芯片,基因芯片的应用领域,基因芯片,基因表达谱,疾病诊断,药物筛选,新基因寻找,测序,基因分型,基因突变,表达谱基因芯片及其检测原理,研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能,检测原理,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间的亲和反应,蛋白质芯片,(protein chip),蛋白质芯片,作用原理,Highthroughput analysis,by using Microarray,Oh,my god!,cDNA Microarray analysis,p193-194,Cluster analysis of multiple experiment,indentified,co-regulated,genes,screening,8,600 genes,at one time,starved fibroblast were provided with serum during 24hrs,increase,decrease,cell cycle,tissue remodeling,early response,p195,基因功能研究技术,基因表达研究技术,SAGE,RNA选择性剪接技术,ISH,Site-drected mutagenesis,基因敲出,基因芯片,蛋白质功能研究技术,蛋白质和核酸的作用技术,蛋白质互作研究技术,基因功能研究技术,基因表达研究技术,SAGE（serial analysis of gene expression）,概念一种以序列测定为基础定量分析全基因表达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。,原理：在转录组水平上，任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可以代表一种特异性的转录产物；用特定的限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸片段序列比国内制成标签。序列标签连接,克隆,测序后,根据其占总标签的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。,基因功能研究技术,基因表达研究技术,RNA选择性剪接技术,基因功能研究技术,RNA选择性剪接技术,基因功能研究技术,基因表达研究技术,基因功能研究技术,基因表达研究技术,原位杂交技术,基因功能研究技术,基因表达研究技术,ISH(in situ hybridization)原位杂交,用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。,原位杂交,核酸原位杂交技术,就是利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。,原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组,DNA,和细胞总,RNA,。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知,DNA,或,RNA,片段。根据其来源和性质可分为,cDNA,探针、基因组,DNA,探针、寡核苷酸探针、,RNA,探针等。,原位杂交的基本原理,当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或PH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补在条件适宜时，就可以全部或部分复性，产生分子杂交。,原位杂交技术包括有：菌落原位杂交（,colony in situ hybridization,）、,斑点杂交法（,Dot blot,）、,Southern,印迹杂交（,Southern blot,）、,Northern,印迹杂交（,Northern blot,）、,组织原位杂交（,Tissue in situ hybridization,）,和基因组原位杂交（,Genome in situ hybridization),原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科