基因工程原理-第4章-质粒和噬菌体载体的基础生物学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主题报告,重组,DNA,技术的应用,全班同学分为六个小组：,六个主题，可以突破，自己选题，保证与基因工程相关,班长负责分组，安排报告时间，从第,14,周开始。,1,2,第四章 质粒和噬菌体载体的基础生物学,第一节 质粒生物学,质粒是在染色体外稳定遗传的复制体,大多数质粒是以双链环状DNA分子的形式存在,共价闭环DNA,cccDNA,开环DNA,ocDNA,3,质粒酶切图谱,6,溴化乙锭影响质粒的超螺旋,7,并不是所有质粒都是环状分子,在多种细菌中都发现有线性质粒,线性质粒的末端保护机制,：,在末端,DNA,发卡环中以重复序列结尾,通过共价结合蛋白来保护末端,8,质粒所携带基因的表型特征,9,质粒的分类,接合型和非接合型,依据是否携带有一套促进细菌接合的转移基因（,tra,基因）,松弛型和严谨型,取决于单个细胞中的拷贝数,10,11,质粒的宿主范围,由它的ori区域决定,严格的宿主范围：如Col E1提供的ori的质粒只能在肠细菌中复制,广宿主范围：复制所需的蛋白质大部分甚至全部都是自己编码的,12,质粒的拷贝数,通过调控质粒复制的起始来决定。,两种调控机制：,通过反义,RNA,调控,（,RNA II,和,RNA I,）,通过关键蛋白与重复区结合来进行调控,Rop,促进,RNA I,和,RNA II,的配对,RepA,蛋白,13,Col E1衍生质粒的复制调控,14,pSC101的ori区域,RepA,蛋白由质粒编码，可以与,ori,区域的重复区结合，抑制,DNA,的合成。,RepA,蛋白通过与自身启动子结合，阻断自身基因转录，抑制自身合成。,RepA,蛋白通过结合两个质粒的重复区序列把它们连接起来，这样避免它们起始复制。（手铐机制）,15,16,质粒的分配和分离稳定性,人们把由于错误的分配而造成的质粒丢失称为分离不稳定性。,Par,分配机制涉及DNA的超旋性,质粒形成多聚体,17,质粒的不相容性,在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内。,如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容。,18,第二节 质粒DNA的纯化,Vinograd的经典方法：CsCl，EtBr密度梯度离心,Binrnboim和Doly：碱裂解法,19,CsCl，EtBr密度梯度离心,20,碱裂解法,NaOH和SDS裂解,乙酸钠中和,离心，取上清,沉淀,TER消化RNA,沉淀，75%乙醇洗,干燥、溶解,21,质粒产量的影响因素,细胞收获时的拷贝数,制备清亮裂解液,宿主细胞中野生型endA基因,22,质粒克隆载体的理想特性,相对分子量小(易于操作、拷贝数高、利于出现单一酶切位点),可以在宿主细胞内产生便于选择的表型特性(便于筛选),存在多种限制性酶的单一位点区域，且最好位于易测表型基因上便于克隆、筛选）,pBR322载体,24,pBR322的限制图谱,25,26,27,pBR322,衍生出更好的载体,28,pUC8质粒,衍生自pBR322,含有复制起始位点(ori)和另两个基因：氨苄青霉素抗性基因和lacZ基因,29,Lac筛选(蓝白斑筛选),pUC质粒含LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝白斑筛选。,30,pUC8,等大肠杆菌质粒的缺点,不能操作大于10kb的DNA片段,大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组DNA分子在宿主细胞中丢失,31,第三节 噬菌体,线性的双螺旋分子大约长48.5kb,每个末端都有短的12个核苷酸的单链5突出，它们在序列上互补，进入宿主细胞后形成环形结构,32,噬菌体的基因组,33,噬菌体非必须DNA,噬菌体基因组大小为,48.5kb,，其中有,15kb,只在噬菌体,DNA,整合到大肠杆菌染色体过程,(,即溶源性感染周期,),中必须，该片段的删除不影响噬菌体感染细菌的能力，也不影响裂解周期中新的,噬菌体颗粒合成，称为,随意,DNA,。,34,噬菌体的生活周期,35,噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期,为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。,噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。,36,37,噬菌体的主要启动子和转录终止位点,噬菌体载体,插入型载体(insertion vector)，部分或全部随意DNA被删除，并在删除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶切位点。,取代型载体,(replacement vector)，随意DNA两侧引入限制性酶切位点，用需克隆的DNA在连入时替代随意DNA。,38,噬菌体克隆载体EMBL3和EMBL4 的结构,39,噬菌体的体外包装,40,41,混合裂解液中串联噬菌体,DNA,的体外包装,42,用单链,DNA,载体进行,DNA,克隆,M13、f1和fd是包含一个环形的单链DNA分子的丝状大肠杆菌噬菌体。,开发成克隆载体,43,M13,生活周期和,DNA,复制,44,45,为什么使用单链载体,噬菌体DNA通过双链环状DNA（RF）的中间体复制。可以纯化出RF进行体外操作。,单链和RF都可以转染大肠杆菌,不存在包装限制,46,47,48,