基因的定位克隆.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因的定位克隆,千奇百怪得突变体,这些突变体就是怎么产生得呢？,突变体,:,就是某个性状发生可遗传变异得材料,或某个基因发生突变得材料,。,水稻,基因定位,(,mapping,):,就是用一定得方法将基因确定到染色体上得实际位置。,一、连锁分析(,Linkage analysis,),1,)概念:,基因定位得连锁分析就是根据基因在染色体上呈直线排列,不同基因相互连锁成连锁群得原理,即应用被定位得基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁得特点进行定位。,2,)重组值(,rebination fraction,),就是基因定位时两个基因间遗传图距得量度,即基因间得遗传距离。如果两个基因间有,1%,得重组值,其遗传图得距离为,1,厘摩。(,centimorgan,cM,),交换值,(RF)(%)=,重组型得配子数,/,总配子数,100%,重组值越大,说明两基因间得距离越远,基因间得连锁强度越小;重组值越小,说明基因间得距离越近,基因间得连锁强度越大。,3,)遗传标记(,genetic marker,),用连锁分析发法进行基因定位需要已知得,DNA,序列作为遗传标记,这些标记按孟德尔方式遗传,标记位点应就是多态得。,4,)遗传多态性:就是指在一个遗传座位上具有一个以上得等位基因,且各个等位基因在群体中出现得频率皆高于,1%,。,二、三点测交,(three-point testcross),与染色体作图,为了进行基因定位,摩尔根与她得学生,Sturtevant,创造了三点测交方法,即将,3,个基因包括在同一次交配中。进行这种测交,一次实验就等于,3,次两点试验。,已知在果蝇中棘眼,(,ec,),、截翅,(,ct,),与横脉缺失,(,cv,),这,3,个隐性突变基因都就是,X,连锁得。把棘眼、截翅个体与横脉缺失个体交配,得到,3,个基因得杂合体,ec ct+/+cv,(,ec,、,ct,、,cv,得排列不代表它们在,X,染色体得真实顺序,),取其中,3,杂合体雌蝇再与,3,隐性体,ec ct cv/Y,雄蝇测交,测交后代如下表。,序号,表型,实得数,1,ec ct+,2125,亲本型,2,+cv,2207,3,ec+cv,273,单交换,I,型,4,+ct+,265,5,ec+,217,单交换,II,型,6,+ct cv,223,7,+,5,双交换型,8,ec ct cv,3,合计,5318,ec ct+/+cv,ec ct cv/Y,测交后代数据,结果分析,1,、归类,2,、确定正确得基因顺序,用双交换型与亲本类型相比较,发现改变了位置得那个基因一定就是处于中央得位置,因为双交换得特点就是旁侧基因得相对位置不变,仅中间得基因发生变动。于就是可以断定这,3,个基因正确排列顺序就是,ec cv ct,。,亲本型,ec ct +,+cv,双交换型,+,ec ct cv,ec ct +,+cv,ec +ct,+cv +,ct ec +,+cv,ec +,+ct cv,ec cv ct,+,ct +,+ec cv,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,3,、计算重组值,确定图距,(1),、计算,ctcv,得重组值,忽视表中第一列,(,ec/+,),得存在,将它们放在括弧中,比较第二、三列:,(ec)ct +,2125,非重组,(+)+cv,2207,(ec)+cv,273,非重组,(+)ct +,265,(ec)+,217,重组,(+)ct cv,223,(+)+,5重组,(ec)ct cv,3,ctcv,间重组率,=(217+223+5+3)/5318,=0、084=8、4%=8、4cM,(3),、计算,ecct,得重组值,忽视表中第三列,(,+/cv,),得存在,将它们放在括弧中,比较第一、二列:,ec ct (+),2125,非重组,+(cv),2207,ec +(cv),273,重组,+ct (+),265,ec +(+),217,重组,+ct (cv),223,+(+),5,非重组,ec ct (cv),3,ecct,间重组率,=(273+265+217+223)/5318,=18、4%=18、4cM,(2),、计算,eccv,得重组值,忽视表中第二列,(,ct/+,),得存在,将它们放在括弧中,比较第一、三列:,ec (ct)+,2125,非重组,+(+)cv,2207,ec (+)cv,273,重组,+(ct)+,265,ec (+)+,217,非重组,+(ct)cv,223,+(+)+,5,重组,ec (ct)cv,3,eccv,间重组率,=(273+265+5+3)/5318,=10、2%=10、2cM,4,、,绘染色体图,ec,cv,ct,10.2,8.4,18.4,18.6,在计算,eccv,与,cvct,得重组值时都利用了双交换值,可就是计算,ecct,时没把它计在内,因为它们间双交换得结果并不出现重组。所以,ecct之间得实际双交换值应当就是重组值加,2,倍双交换值。即,18、4%+20、1%=18、6%,。,当三点测交后代出现,8,种表型时,表明有双交换发生,此时需用,2,倍双交换值来作校正。若,3,个基因相距较近,往往不出现双交换类型,后代只有,6,种表型,无需校正。,标记,1,标记,2,目标基因,三、图位克隆,图位克隆(,map-based cloning,)又称定位克隆,该方法分离基因就是根据目得基因在染色体上得位置进行基因克隆得一种方法,其原理就是根据功能基因在基因组中都有相对稳定得基因座,在利用分子标记技术对目得基因进行精确定位得基础上,使用与目得基因紧密连锁得分子标记筛选,DNA,文库,从而构建得基因区域得物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行(,chromosome walking,)逼近目得基因或通过染色体登陆(,chromosome landing,)(,Tanksley et al、,1995,)得方法最终找到包含目得基因得克隆,最后通过遗传转化与功能互补验证最终确定目得基因得碱基序列。,图位克隆得特点就是无需预先知道基因得,DNA,顺序,也无需预先知道其表达产物得有关信息,但应有以下,两方面,得基本情况,。,一就是,有一个根据目得基因得有无建立起来得遗传分离群体,即定位群体,如:,F2,、,DH,、,BC,、,RI,等,。,二就是,开展以下几项工作:(,1,)首先找到与目得基因紧密连锁得分子标记;(,2,)用遗传作图与物理作图将目标基因定位在染色体上得特定位置;(,3,)构建含有大插入片段得基因组文库;(,BAC,或,YAC,);(,4,)以与目得基因连锁得分子标记为探针筛选基因组文库;(,5,)用获得阳性克隆构建目得基因区域得重叠群;(,6,)通过染色体步行、登陆或跳跃获得带有目得基因得大片段克隆;(,7,)通过亚克隆获得带有目得基因得小片段克隆;(,8,)通过遗传转化与功能互补验证最终确定目标基因得碱基序列,M1,M2,构建遗传图谱,构建物理图谱,染色体步移:,Chromosome Walking,筛选基因组文库,序列分析与功能鉴定,对于基因组还未测序得物种可通过染色体步移得方法进行定位,但就是比较费时费力,而对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成得物种,则不在利用染色体步移得方法进行定位,直接从构建遗传图谱到构建物理图谱,最后确定目标基因得候选基因,再通过互补实验进行验证。,四、分子标记,分子标记就是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础得遗传标记,就是,DNA,水平遗传多态性得直接得反映。,现在,DNA,分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。,分子标记得种类,一、基于分子杂交技术得分子标记技术,:,限制性片断长度多态性,(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP,),二、基于,PCR,技术得分子标记技术:随机扩增多态性,DNA(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD,),简单重复序列,(Simple Sequence Repeat,SSR,),三、基于限制性酶切与,PCR,技术得,DNA,标记,:,扩增片段长度多态性,(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP,),四、基于,DNA,芯片技术得分子标记技术,:,核苷酸多态性,(Single Nucleotide Polymorphism,SNP,),SSR,即微卫星,DNA,就是一类由几个(多为,1-5,个)碱基组成得基序(,motif,)串联重复而成得,DNA,序列,其长度一般较短,广泛分布于基因组得不同位置,如(,CA,),n,、(,AT,),n,、(,GGC,),n,等重复。不同遗传材料重复次数得可变性,导致了,SSR,长度得高度变异性,这一变异性正就是,SSR,标记产生得基础。尽管微卫星,DNA,分布于整个基因组得不同位置,但其两端序列多就是保守得单拷贝序列,因此可以根据这两端得序列设计一对特异引物,通过,PCR,技术将其间得核心微卫星,DNA,序列扩增出来,利用电泳分析技术就可获得其长度多态性,即,SSR,标记。,SSR,五、基因初步定位,目得基因得初步定位,(mapping the target gene),就是利用分子标记技术在一个目标性状得分离群体中把目得基因定位于染色体得一定区域内。,初定位通常使用近等基因系法,(near-isogenic lines,NILs),或群组分离分析法,(bulk segregant analysis,BSA),。,近等基因系就是指只有目标性状基因有差异,其它性状基因相同得,2,个群体,可以通过连续回交得途径获得。,由于近等基因系需要连续得回交,所需得时间较长,因此,Michelmore,等,(1991),提出了群组分离分析法(,BSA,法),将分离群体中研究得目标性状根据其类型,(,如抗病、感病),分成,2,组,将每组内一定数量得植株,DNA,等量混合,形成两个池,这两个池仅在目标性状,(,如抗病性,),上有差异。利用分子标记技术寻找两个池得扩增谱带得差异,这种多态性极可能与目标基因连锁。再用所有得分离后代单株,验证该多态性就是否真正与目标基因连锁及连锁距离得确定。,六、精细定位,在初步定位基础上,设计并筛选离亲本更近且在两亲本之间表现多态性得引物,然后利用,F2,群体中得突变体检测筛选到得亲本间多态性引物,逐步缩小范围,将目得基因定位到染色体上一个很小得物理区间内。,举例说明:,利用,SSR,标记进行水稻,drawf1,基因得定位,基本实验方法,F2,定位群体构建,植物总,DNA得提取,PCR,反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,引物设计,F2,群体构建,引物设计常用软件及网站,设计软件:,primer3、0,primer5、0(寻找酶切位点,设计引物),Webprimer,序列分析软件:,DNAstar(分析序列特征,引物质量,编辑序列),基因得初步定位(,BSA,法),筛选亲本间多态性引物,筛选池间多态性引物,小群体验证,初步定位带型分析,正常亲本,突变亲本,突变池,正常池,RM1,(亲本之间有多态,池间无多态),RM2(,亲本与池之间均有多态),正常亲本,突变亲本,突变池,正常池,总结:如果亲本与池之间同时存在多态性得引物很有可能与目标基因连锁,因此再通过小群体进行验证重组交换值应该小于,50%,),则可将目标基因定位到与其连锁得标记所在得染色体上。,我们初步定位得结果就是否准确呢？接下来就要用一些突变体进行验证,瞧一下我们所选定得标记与目标基因就是否真正连锁,遗传距离,=,(单交换,+,双交换,2,),/,(突变体总数,2,),100,引物名称,连锁植株数目,单交换植株数目,双交换植株数目,RM1,150,19,1,RM2,158,11,1,RM3,162,8,0,RM4,155,15,0,怎样判断目标基因与这些标记之间得位置关系及距离远近呢？,A P +-5 10 18,A P +-6 11 12 16,RM2,RM3,交换率越高得标记离目标基因越远,反之离目标基因越近,即对应得交换株越多得标记离目标基因远,交换株越少得标记离目标基因越近。,RM1,RM2,drawf1,RM3,RM4,3、8cM,2、4cM,2、4cM,2、0cM,CHR、6,Marker,Dist、(cM),目标基因所在区域得分子标记连锁图,精细定位,扩大定位群体,设计离目标基因更近得分子标记,并筛选在两亲本之间存在多态性得分子标记,用筛选出得多态性标记引物检测定位群体,最终将目标基因锁定在一个较小得物理区间内,目标基因所在染色体上相应区段得跨叠,BAC,克隆群,七、候选基因得确定,方法,(,1,),查阅相关资料,比较分析定位区间内基因得同源基因得功能,在其它物种就是否引起相同或相似得表型,找到最有可能得候选基因;(,2,)进行,mRNA,水平得分析,瞧其表达在正常植株与突变体中就是否发生了改变,如长度变化,表达量变化等;(,3,)进行序列测定,比较该基因在正常植株内与突变体内核酸序列与氨基酸序列就是否发生了改变;(,4,)进行互补实验验证候选基因就是否为目标基因。,RT-PCR,(,1,)提取正常植株与突变体得总,RNA,(,2,),RT-PCR,(,3,)琼脂糖凝胶电泳分析,观察候选基因表达量就是否不同及产物大小就是否不同。,候选基因,mRNA,水平分析,长度发生变化表明什么？,表达量增加、或降低则表明什么？,序列测定,RT-PCR,PCR,产物连接到,T,载体,转化大肠杆菌,送测序公司测序,互补实验,构建互补载体,遗传转化突变体,观察突变表型就是否恢复,