毒理突变张老师.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,遗传与变异的普遍性,突变,：变异的原因之一，,起源于基因或染色体。,分自发突变,spontaneous mutation,和诱发突变,induced mutation,第一节、概 述,1,突变,：自发突变和,诱发突变,(induced mutation),20,世纪,60,年代，产生了,遗传毒理学,（,genetic toxicology,）：研究化学物质和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康效应，即是诱发突变带来的危害。,第一节、概 述,2,致突变作用,（,mutagenesis,）：外来因素引起细胞核中的遗传物质发生的可随细胞分裂而传递的改变，这种突变的发生及过程称为致突变作用。,突变的概念,3,一,、,基因突变,二、,染色体畸变,三、,非整倍体和多倍体,第一节 突变的类型,6,1.,借助光学显微镜可以观察到的为,染色体畸变（结构和数目）,。,2.,借助光学显微镜不能观察到的称,基因突变,。,光学显微,镜分辨率,0.2m,4.710,6,核苷对，由此可分为分子水平和细胞水平。,基因突变亦称,点突变,，通过表型或分子生物学手段观察。,突变可分为：,7,某一碱基性能改变或脱落所致的突变。,如错误配对,正常A-T、G-C,转换,transition,：,嘌呤换嘌呤,嘧啶换嘧啶颠换,transversion,:,嘌呤换嘧啶,嘧啶换嘌呤。,一、基因突变,1.碱基置换(base substitution),8,发生一对或几对（3对除外）的碱基减少或增加，从受损点开始读码框完全改变，形成错误密码，转译为不正常的氨基酸。,后果：,一、基因突变,2.,移码突变（frameshift mutation）：,9,染色体畸变,（chromosome aberration）,染色体的结构改变，需要在M期进行观察。,染色单体型畸变,(chromatid-type aberration),染色体型畸变,(chromosome-type aberration),二、染色体畸变,10,染色体结构的异常通常是染色体或染色单体断裂所致。（,break,）,1.,缺失,（,deletion,）：,染色体上丢失了一个,片段。,2.,重复,（,duplication,）：,在一套染色体里，,一个片段出现不止一次。,二、染色体畸变,11,3.,倒位,（inversion）：某一染色体两次断裂后，其中间段倒转180度重接。,臂间倒位 pericentric inversion,颠倒的片断包括着丝点。,臂内倒位 paracentric inversion,颠倒的片断不包括着丝点。,二、染色体畸变,12,4.,易位,（translocation）：从一对染色体断 下的节段接到另一对染色体上称为易位。,相互易位：reciprocal translocation,两个非同源染色体片断的交换。,非相互易位:non-reciprocal translocation,其中一个非同源染色体出现缺失。,二、染色体畸变,13,1.,非整倍体（,aneuploidy,）：,比二倍体多或少一条 或多条染色体。,（,1,）,缺体：少一对同源染色体。,（,2,）单体：少一条同源染色体。,（,3,）三体：多一条同源染色体。,（,4,）四体：多一对同源染色体。,三、染色体数目异常,14,三、染色体数目异常,2,.,多倍体,(polyploidy),:,染色体数目成倍增加。大于二倍体的整倍体畸变，称为多倍体。,三倍体,四倍体,15,直接以,DNA,为靶的诱变：,引起突变的,DNA,变化,不以,DNA,为靶的诱变（纺锤丝抑制、对酶促过程的作用）：,引起突变的细胞分裂过程的改变,其他改变,以,DNA,合成、复制和修复相关的酶为靶,第三节 化学毒物致突变作用机制及后果,16,（1）.,碱基错配,烷化剂,(alkylating agent)：,对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用的物质。如烷基硫酸酯、N-亚硝基化合物，可提供烷基,与DNA共价结合,，产生烷化作用。,1.碱基损伤,一、,引起突变的DNA变化,17,（1）.,碱基错配,鸟嘌呤的,N,7,烷化有正常配对特性，,其,O,6,烷化易引起,G,：,CA,：T,转换。,此外，烷化还可改变,DNA,二级结构，刺激碱基丧失，形成,AP,位点，多引起颠换。,1.碱基损伤,18,（2）.平面大分子嵌入DNA链,大分子以静电形式通过吸附作用而嵌入,DNA,单链的碱基之间或双链的核苷酸之间。由于其长度恰好是,DNA,单链相邻碱基距离的,2,倍，无论对新合成的互补链上嵌入或是对模板链上两碱基间的嵌入，都会造成少一个或多一个碱基的情况，从而造成,移码突变,。（,9-aminoacridine 9-,氨基吖啶）,1.碱基损伤,19,（3）.碱基类似物取代,如,5-,溴脱氧尿嘧啶核苷与胸腺嘧啶结构相似，取代胸腺嘧啶,T,与腺嘌呤,A,配对。,其异构体还可以与鸟嘌呤G,配对。,1.碱基损伤,20,（4）.碱基的化学结构改变或破坏,碱基被氧化，改变核苷酸化学组成,（,亚硝酸盐,的氧化性脱氨）,DNA,链断裂,.,自由基的作用,(,甲醛,在体内形成活性氧,ROS,或自由基,),1.碱基损伤,21,1,.,非整倍体形成原因,：,同源染色体不能适当分离,2.,多倍体形成原因,：,（,1,）染色单体不分离；,（,2,）配子为二倍体；,（,3,）一卵多精。,二、,引起突变的细胞分裂过程的改变,22,机制：多与纺锤体有关,（1）与微管蛋白二聚体（构成纺锤体的,基本成分）结合，如秋水仙素,（2）与微管上的巯基结合，致癌物常与,之特异性结合，抑制分裂,（3）微管破坏,（4）中心粒移动受阻,二、,引起突变的细胞分裂过程的改变,23,与,DNA,合成、复制、修复,有关的,酶系统,受到损伤，与基因组稳定性和基因表达调控相关的酶和蛋白质的破坏,均可影响,DNA,高保真复制、基因表达调控、机体的自身修复等。,可诱发基因突变或染色体畸变。,三、其他改变,24,1,致,死性突变：,(1),显性,:,不能受精,着床前或着床早期,死亡,;,(2),隐性,:,纯合或半合子,死亡,。,2,非致死性突变,：,(1),显性,:,遗传发病率增加，,新病种出现,；,(2),隐性,:,遗传负荷增加,。,（一）、生殖细胞突变,四,、突变的后果,25,基因库,：,某一物种在特定时期 中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。,遗传负荷,：,指一种物种的群体中每一个体携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。,（一）、生殖细胞突变,四,、突变的后果,26,1.致癌,2.致畸（胚胎体cell突变）,3.动脉粥样硬化,4.衰老,（二）体细胞突变,四,、突变的后果,27,人体细胞数,10,14,个，每个细胞内,DNA,每日出现的损伤数可达,4000,之多。,损伤后可出现下列情况,:,(1).,严重时导致,cell death;,(2).,损伤被,修复,;,(3).,引起,突变,.,第四节 机体对致突变作用的影响,28,直接修复,切除修复,一、DNA损伤修复,错配修复,双链断裂修复,交联修复,29,针对：,UV损伤,所产生的,胸腺嘧啶二聚体,依赖：光裂合酶（photolyase）,机制：,紫外线或短波可见光的能量对嘧啶二聚体进行单体化，达到修复目的，光复活可一步完成，人类光裂合酶主要存在于淋巴细胞和成纤维细胞之中,。,（一）光复活（photoreactivation）,30,依赖一种特殊专一作用的蛋白,烷基转移酶的作用，将结合在嘌呤上的烷基转移下来，使嘌呤恢复正常结构。,如,O,6,甲基鸟嘌呤,DNA,甲基转移酶（,MGMT,）,。,在烷化剂对嘌呤烷化作用的同时，,可诱导,细胞产生这种蛋白。,如烷化剂,MNNG(N,3,9-,甲基,-N-,硝基,-N-,亚硝基呱,),，即有此种作用。,属于复制前修复,（二）、“适应性”反应,31,核苷酸切除修复,(,Nucleotide excision,repair,NER),泛基因组核苷酸切除修复,(global genome NER,GG-NER),识别损伤,在解螺旋酶（,helicase,）作用下，打开受损,DNA,双链，内切酶除去受损的寡核苷酸链；,在修复聚合酶作用下，以对应的,DNA,链为模板，合成新链；,再由,DNA,连接酶封闭,恢复原有的,DNA,序列。,(三）、,切除修复（excision repair）,32,碱基切除修复,（,Base excision,repair,BER,）,DNA,糖苷酶DNA,glycosylase,）识别异常碱基，切断碱基与脱氧核糖连接的键，使受损碱基脱落，产生一个无嘌呤或无嘧啶位点（,AP,），,AP,内切酶切断,DNA,链，聚合酶及连接酶完成修复过程,较核苷酸切除修复,特异性强。,(三）、,切除修复（excision repair）,33,转录偶联修复,（,transcription-coupled repair,TCR-NER,）,哺乳动物细胞内存在一种与基因转录活性状态相关联的核苷酸切除修复，,TCR-NER,活性转录链,/,基因的核苷酸切除效率优于非转录链,/,基因的修复。,(三）、,切除修复（excision repair）,34,识别并除去错配的碱基对,。,如 G:T，A:C。,错配碱基的识别,修复蛋白的募集,切除含错配碱基的,DNA,链,修补合成,(四）、,错配修复（mismatch repair）,35,复制后修复,（,post replication repair,，,PRR,）,达不到完全恢复，只能通过填补损伤部位，使复制继续进行，但损伤部位仍然存在，,是一种耐受过程,，以保证细胞生存。,（五）、双链断链修复,36,跨越损伤修复机制：,DNA,聚合酶转换机制,模板转换机制,同源重组,DNA,双链断裂修复,同源重组修复,(homologous,recombinaion,HR),非同源末端连接,(non-homologous end-joining,NHEJ),（五）、,复制后修复,37,无误交联修复,：,易误交联修复,（六）、交联修复,交联修复,：,在,糖基酶的催化下解开交联的一条臂，降解双螺旋，使链内交联转变为链内二核苷酸加合物，再切除修复。,38,呼救性修复,（SOS repair）,为紧急修复,是指,DNA,受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种,DNA,修复方式,.,修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率,但留下的错误较多，故又称为,易错修复,(error-prone repair),使细胞有较高的突变率。,（七）、,呼救性修复,39,用国际通用呼救密码（,save our soul来表示，称为,SOS,修复系统。,特点,：,诱导修复,明显误差,高频突变,多基因参与,:,recA,lexA,recB,recC,（七）、,呼救性修复,40,以上所述为,DNA,损伤后的修复，只要修复无误，则突变就不会发生,若修复错误或未经修复，则损伤就固定下来，并可通过细胞分裂传递，于是发生了突变,因此诱发突变是一个可修复控制的过程，失控才真正发生,mutation,。,summary,DNA损伤的修复,41,（一）代谢酶遗传多态性,遗传多态性是一个衡量遗传变异的数据，即群体中多态基因的比例。,标准,：最常见等位基因频率不超过0.99。,意义,：不同个体对致突变作用的敏感性,不同。,二、遗传因素对致突变作用的影响,42,（一）代谢酶遗传多态性,1,氧化代谢酶 P-450,AHH（芳烃羟化酶）能催化PAHs活化，,可分高诱导表型和低诱导表型,2,酯酶：,活性有个体差异 eg 环氧水化酶（EH）双重作用：（1）活化酶、B（a）P代谢,（2）解毒酶,3,GST,具有多态性，为体内重要解毒酶系之一。,二、遗传因素对致突变作用的影响,43,1,MGMT（O6,-,甲基鸟嘌呤,-,DNA,-,甲基转移酶）,特异性修复酶，去烷基，有明显的组织差异和个体差异,2,聚二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）,另类DNA断裂修复酶，可抑制或促进肿瘤发生。,二、遗传因素对致突变作用的影响,（二）修复功能个体差异,44,第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法,1,观察的效应终点类型,遗传学终点,（genetic end point）：试验观察到的现象所反映的各种事件。,一、观察项目的选择,45,国际环境致突变物致癌物防护委员会,（ICPEMC）,1983年将,遗传学终点分为五类：,现将遗传学终点归纳为4类：,（,1,）基因突变,（,2,）染色体畸变,（,3,）染色体组畸变,（,4,）,DNA,原始损伤,一、观察项目的选择,46,2成套的观察项目,要求用一组试验配套。,原因,：,1个诱变试验只能反映一个或两个终点,体外试验又在生物转化方面与体内试验有差距,体细胞和生殖细胞突变后果也不同,中心原则遗传学终点要齐全。,要求,：,体内体外兼顾，体细胞生殖细胞兼顾，,原核细胞真核细胞兼顾，各种终点兼顾。,一、观察项目的选择,47,使用菌株：,鼠伤寒沙门氏菌,（Ames test）,正向突变,野生型 突变型(组aa缺陷型，组aa操纵子,回复突变,突变，须依赖外源性组aa生长),遗传终点：（,1）碱基置换,（2）移码,（3）碱基置换+移码,（4）交联？,二、常用致突变试验,（一）细菌回复突变试验,48,(二)微核试验,micronucleus MN,微核来源：染色体的无着丝点断片，整条染色体（纺锤丝损伤时）,遗传终点,：,（1）染色体畸变(完整性改变),（2）染色体组畸变(分离改变),二、常用致突变试验,49,(三)染色体畸变分析,遗传终点,：（,1）染色体畸变,（2）染色体组畸变,结构畸变：裂隙、断裂、断片、无着丝粒环、缺失等,数目畸变：单倍体、缺体、三倍体、四倍体,二、常用致突变试验,50,（四）SCE（sister-chromatid exchange）,原理,：,5-Brdu能与T竞争而与A结合，经两个分裂周期后染色处理，光镜下观察交换的染色单体数，计数SCE数。,检测终点,：,染色体畸变,二、常用致突变试验,51,原理,：,雄蝇X染色体有突变，可传给F1代雌蝇F2代雄蝇,若出现隐性致死性突变，F2代雄蝇比雌蝇数目少一半。,优点,：真核生物，毒物代谢与哺乳动物近似，但仍有差异，周期短，饲养方便，但外推及人仍须慎重。,检测,：点突变，小缺失，重排,（五）果蝇伴性隐性致死试验（SLRL）,二、常用致突变试验,52,体内,试验，,生殖cell,遗传性损伤,雄性子鼠接触受试物后与雌鼠交配，观察胚胎死亡情况。,观察,：染色体断裂（缺失、重复），染色体重排（不分离，不平衡分离）非整倍体（单体或三体）,(六)显性致死试验dominant lethal test,二、常用致突变试验,53,指在S期DNA半保留合成程序之外的 DNA合成，是对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程。,该法简便、经济、快速,。,检测：DNA完整性,（七）程序外DNA合成试验（UDS）（unscheduled DNA synthesis）,二、常用致突变试验,54,电泳时损坏的DNA游离出细胞核，形成彗星形状。DNA受到致突变物的损坏愈大，DNA碎段就愈多，愈小的DNA碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。,二、常用致突变试验,（八）单细胞凝胶电泳（SCGE）试验,（,Single cell gel electrophoresis，SCGE,）,（彗星试验 comet assay）,55,彗星实验,彗星的长度与DNA的损害程度有关,是分析DNA受损害程度的很好方法。,检测：DNA完整性,56,转基因小鼠致突变检测系统,微核自动化检测技术,FISH技,术,（九）其他新技术,二、常用致突变试验,57,设立对照：阴性对照,/,溶剂对照；阳性对照。,体外试验的活化系统,哺乳动物细胞介导,S9(,常用,),纯化酶和基因工程,与致癌试验的关系。,其结果在安全性评价中的作用,三、致突变试验中的一些问题,58,第七章 外源化学物,致突变,作用,一、掌握,基本概念,化学物致突变的类型,遗传学终点及观察项目选择的原则,突变的后果后果,二、熟悉,致突变作用机制及,机体的修复系统,常用的致突变试验,59,祝同学们学习进步!,60,