细菌的分离纯化和接种实验.doc

环工综合实验
细菌得分离纯化与接种实验
实验报告
环境科学与工程学院实验中心
实验题目
细菌得分离纯化与接种实验
实验类别
综合
实 验　室

实 验 时 间

实验环境
温度：
湿度:
同组人数

一、 实验目得
１、掌握倒平板得方法与几种常用得分离纯化微生物得基本操作技术;
2、了解不同得微生物菌落在斜面上、固体培养基中得生长特征；ﻭ3、进一步熟练与掌握微生物无菌操作技术;ﻭ4、掌握微生物培养方法。

二、 实验仪器及设备
仪器:无菌小试管8支、盛无菌水得锥形瓶1个、盛无菌基础培养基得锥形瓶１个、无菌玻璃涂棒、5ｍL无菌移液管1支、1mL无菌移液管４支、接种环、煤气灯、无菌培养皿10套
试剂:无菌水、无菌基础培养基、未知菌种、酵母菌、羽毛溶解菌、湖水
三、实验原理
从混杂得微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物得过程称为微生物得分离与纯化．
常用得分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法,平板划线法。稀释涂布平板法步骤:倒平板（标记培养基名称)－制备湖水稀释液-涂布-培养(平板倒置)－挑菌落；平板划线法步骤:倒平板（标记培养基名称)－制备湖水稀释液－划线－培养(平板倒置）－挑菌落.
培养斜面:试管中加培养液(标记培养基名称)—斜放试管制斜面—选取菌种—划线—培养（试管倾斜)—挑菌落。

实验原理问答题：
１、为什么湖水用10－4、１0-5　、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低得浓度？
答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中得微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在,否则一个菌落就不只就是代表一个个体生长而成得，从而方便计数。
2、为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?
答：第一，为了防止重力对菌落得生成产生影响;第二,为了防止培养基中得水分蒸发后凝结在壁上,滴落后影响菌得生长与形态观察;第三，防止培养基干涸。
３、微生物常用接种方式有哪些?进行微生物接种应该注意哪些方面?
答:⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种,三点接种,浇混接种，液体接种,注射接种,活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理,接种过程必须在煤气灯旁进行,接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到得器材与菌种培养基有序编号放置,操作时应避免已经灭菌处理得材料用具与周围得物品得接触，往培养基就是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤
１、制备细菌稀释液:ﻭ使用5mｌ移液管加４、5ｍl无菌水放入贴有10—3、１0—4、10－5、10-6标签得小试管中,用一根1ml得无菌移液管吸取１0-2得湖水稀释液0、5ml放入贴有1０-３标签得小试管中，1ｍl得无菌移液管吸洗三次以混匀。然后用另外一支1ｍl得无菌移液管从贴有１0-３标签得小试管中吸取10-3得湖水稀释液0、5ml放入贴1０—4标签得小试管中，吸洗三次以混匀。同法依次连续稀释至1０—５、10—6稀释液。ﻭ2、做平板(10个）:
一人持盛培养基得锥形瓶置火焰旁边，将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰;另一人拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝,迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布在培养皿底部,然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
剩余培养基倒入4个无菌小试管中（每个小试管盛装约1/４体积培养液)，试管倾斜放置,做成斜面.
３、湖水中微生物含量得测定：
分别从10-4、１0—5、１０－6土壤稀释液中,用各自润洗过得移液管吸取０、2ｍl得菌液放在不同得平板上,摇晃并涂布均匀,平板平置在桌面，依法再做一组平行样。
4、空气、自来水中细菌含量得测定:ﻭ在一个平板中，加入０、2ｍl得自来水,摇晃并涂布均匀,并做一组平行样；打开一平板盖，使培养基暴露在空气中1０分钟,盖上皿盖。再做一组平行样。
5、微生物接种:
将灼烧灭菌得接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长得培养基上,待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出,接种环不能通过火焰,应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕,接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞．再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架,即可进行培养.选择两个未知菌种、一个酵母菌菌种、一个羽毛溶解菌菌种接种到斜面上。
6、培养:
斜面以及倒置后得平板全部放入恒温培养箱内30℃培养．

五、实验注意事项
1、倒平板在培养基温度为45度以上进行.
2、微生物实验尽量保证实验环境在无菌状态

六、思考题
１、氧化亚铁硫杆菌( Thｉoｂaciｌlｕsfｅrrooxiｄans,Ｔ、f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉与沉积硫内，尤以金属硫化矿与煤矿等酸性矿坑水(pH<4）中最为常见。其化能自养,专性好氧，嗜酸,革兰氏阴性,,主要利用利用CＯ2为碳源,并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。请思考其分离纯化得方法与步骤。

答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液,在实验室用9K或Leatｈeｎ培养基反复分离纯化。
具体方法一：取菌液１0mL,加入盛有10０mL灭菌９K或Leatheｎ液体培养基得25０mL锥形瓶中,在30℃，120r/miｎ得空气浴恒温摇床中培养,直至锥形瓶中得溶液变为红棕色，一般需4天。反复几次。然后采用固体培养基稀释涂布平板法分离纯化菌种以获得纯培养。在９Ｋ固体培养基上7～１0天出现圆形凸起状小菌落(ｄ≈1mｍ),将单独小菌落挑起,每个小菌落分别接种到装有５mL液体培养基得小试管中,以棉球封口，培养条件同上直到小试管得液体颜色也变成红棕色。重复在液体培养基中扩大培养与在平板上反复分离，最后分离出优良菌株。
具体方法二：取菌液１ｍL,用pH=２、5得稀硫酸按每次稀释１0倍,依次稀释成１０-1,10—2,10—3,１0-4,10-５，1０-6浓度得稀释液。吸取稀释度为１０—4，10—5,１0-6稀释样各０、２ｍL,分别接种到三个事先准备好得灭菌９Ｋ琼脂固体培养基，涂布均匀，正置于30℃恒温培养箱中静置培养,次日倒置继续培养,直至固体培养基表面出现圆形凸起状小菌落（d≈１mm),一般需两周。将单独小菌落挑起，每个小菌落分别接种到装有5mL9K液体培养基得小试管中，以棉球封口,放在３0℃摇床中振荡培养,反复进行直到纯化为止。
２、某果园业主想知道其果园土壤中得微生物数量,请帮助设计方案(详细说明）。
答:取一定重量得土壤，称取1g，置于100ｍｌ无菌水中,振荡、离心，取上清液得到土壤浸出液（瞧做土壤中得微生物全部转移至水中)。对浸出液做梯度稀释，取一定稀释度得溶液,在基础培养基上以平板涂布法培养后数菌落数，然后乘上稀释倍数,就可得到1g土壤中该微生物得数量。

３、某生物实验室需要保存某菌种(白腐真菌),预计一年后需要再次接种使用,请问，该菌种应该如何保存？
答:液体石蜡保藏法(将灭菌液体石蜡注入已长好菌得斜面上隔绝空气,直立试管低温保存)或滤纸保藏法(将灭菌滤纸浸满菌悬液,放入安瓿管真空干燥，熔封保存）或冷冻真空干燥保藏法、斜面保藏法、穿刺保藏法、砂土管保藏法.