环介导等温扩增技术原理课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主要内容,等温扩增技术简介,等温扩增技术的应用前景,几种等温扩增技术比较,环介导的等温扩增技术原理,环介导的等温扩增演示,环介导的等温扩增检测,等温扩增的概念等温扩增技术,(Isothermal Amplification Technology),是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。,与,PCR,技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。,等温扩增的优势应用,特异性高,分析速度快,成本低,突变率低,不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作,检测核酸成分比检测微生物本身危险性小,方便诊断,环介导等温扩增核酸技术优势,LAMP,克服了传统,PCR,反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。,操作简单：只需一个水浴锅,快速高效：不需要预先的双链,DNA,热变性避免了温度循环而造成的时间损失,特异性强：针对靶序列,6,个区域设计的,4,种特异性引物。,6,个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。,高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比,PCR,高出数量级的差异。,缺点：由于,LAMP,扩增是链置换合成，靶序列长度最好在,300bp,以内。,500bp,则较难扩增。故不能进行长链,DNA,的扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。,环介导等温扩增核酸技术,环介导等温扩增,(Loop-mediated isothermal amplification,简称,LAMP),是利用,4,个特殊设计的引物和具有链置换活性的,Bst DNA,聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增,DNA,的新技术。,LAMP,技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。,环介导等温扩增原理,6065,是双链,DNA,复性及延伸的中间温度，,DNA,在,65,左右处于动态平衡状态。利用引物合成的,DNA,链取代模板互补链。,扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的,Bst DNA,聚合酶,需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物,LAMP,法并不需要对双链,DNA,进行预变性及进行温度循环。,针对靶基因的,六个不同的区域,，基于靶基因,3,端的,F3c,、,F2c,和,Flc,区以及,5,端的,Bl,、,B2,和,B3,区等,6,个不同的位点设计,4,种引物。,LAMP,反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引物被使用。,FIP(Forward Inner Primer),：上游内部引物，由,F2,区和,F1C,区域组成，,F2,区与靶基因,3,端的,F2c,区域互补，,F1C,区与靶基因,5,端的,Flc,区域序列相同。,F3,引物,：上游外部引物,(Forward Outer Primer),，由,F3,区组成，并与靶基因的,F3c,区域互补。,BIP,引物,：下游内部引物,(Backward Inner Primer),，由,B1C,和,B2,区域组成，,B2,区与靶基因,3,端的,B2c,区域互补，,B1C,域与靶基因,5,端的,Blc,区域序列相同。,B3,引物,：下游外部引物,(Backward Outer Primer),，由,B3,区域组成，和靶基因的,B3c,区域互补。,环介导等温扩增引物设计,环介导等温扩增引物设计,LAMP,反应引物与对应模板区域,环介导的等温扩增技术原理,内引物,FIP,的,F2,与其模板的互补序列,F2c,结合，在,Bst DNA,聚合酶作用下，从,F2,的,3,末端开始启动,DNA,合成，合成一条以,FIP,为新的,DNA,单链并与模板链结合形成新的双链,DNA,。,环介导的等温扩增技术原理,以,F3,为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以,FIP,为起始的,DNA,单链被置换而脱离产生一单链,DNA,，其在,5,末端,F1c,和,F1,区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。,环介导的等温扩增技术原理,引物,BIP,的,B2,与模板链,B2c,区互补配对，合成以,BIP,为起始的新链，并与模板链互补形成,DNA,双链。同时，,F,端的环状结构将被打开，外引物,B3,与模板上,B3c,杂交后，以其,3,末端为起点也开始合成新链，并使以,BIP,为起始的,DNA,单链从模板链上脱离下来，形成以,FIP,和,BIP,为两端的单链。因为,B1C,与,B1,互补，,F1C,与,F1,互补，两端自然发生碱基配对，这条游离于液体中的,DNA,单链分别在,F,和,B,末端形成两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为,LAMP,的基础结构。,形成,LAMP,基础结构,环介导的等温扩增技术原理,环介导等温扩增过程演示,反应时间对,LAMP,的影响,乔岩梅,.,炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究,D.,中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）,2007,Effect of reaction time on the LAMP reaetion.Lanes1,DNA marker(DL2000),with2000,1000,750,500,250 and 100bP:lanes2,一,5,LAMP amPlification Produets for 15,min,30min,45min,60min,respectively:lane6,without DNA template in the reaction.,环介导等温扩增检测,反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测（浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。,焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在,LAMP,反应过程中，,dNTP,析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的,Mg2+,结合，产生副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现,LAMP,反应中焦磷酸镁沉淀的形成与所产生的,DNA,量之间的关系，发现两者生成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在,400 nm,处有吸收峰，从而进行,LAMP,的定量检测。,荧光检测：,LAMP,有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序列扩增至,109,l010,倍，所以当反应液中加入核酸染料,SYBR Green I,后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持,SYBR Green I,的橙色不变。,检测流程图,