多肽氨基酸知识.docx

一)基本氨基酸
组成蛋白质得20种氨基酸称为基本氨基酸。它们中除脯氨酸外都就是α-氨基酸,即在α-碳原子上有一个氨基。基本氨基酸都符合通式,都有单字母与三字母缩写符号。
按照氨基酸得侧链结构,可分为三类:脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸与杂环氨基酸。
1、脂肪族氨基酸 共15种。
侧链只就是烃链:Gly, Ala, Val, Leu, Ile后三种带有支链,人体不能合成,就是必需氨基酸。
侧链含有羟基:Ser, Thr许多蛋白酶得活性中心含有丝氨酸,它还在蛋白质与糖类及磷酸得结合中起重要作用。
侧链含硫原子:Cys, 
Met两个半胱氨酸可通过形成二硫键结合成一个胱氨酸。二硫键对维持蛋白质得高级结构有重要意义。半胱氨酸也经常出现在蛋白质得活性中心里。甲硫氨酸得硫原子有时参与形成配位键。甲硫氨酸可作为通用甲基供体,参与多种分子得甲基化反应。
侧链含有羧基:Asp(D), Glu(E)
侧链含酰胺基:Asn(N), Gln(Q)
侧链显碱性:Arg(R), Lys(K)
2、芳香族氨基酸包括苯丙氨酸(Phe,F)与酪氨酸(Tyr,Y)两种。 酪氨酸就是合成甲状腺素得原料。
3、杂环氨基酸 
包括色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His)与脯氨酸(Pro)三种。其中得色氨酸与芳香族氨基酸都含苯环,都有紫外吸收(280nm)。所以可通过测量蛋白质得紫外吸收来测定蛋白质得含量。组氨酸也就是碱性氨基酸,但碱性较弱,在生理条件下就是否带电与周围内环境有关。它在活性中心常起传递电荷得作用。组氨酸能与铁等金属离子配位。脯氨酸就是唯一得仲氨基酸,就是α-螺旋得破坏者。
B就是指Asx,即Asp或Asn;Z就是指Glx,即Glu或Gln。
基本氨基酸也可按侧链极性分类:
非极性氨基酸:Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种
极性不带电荷:Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七种
带正电荷:Arg, Lys, His
带负电荷:Asp, Glu
(二)不常见得蛋白质氨基酸
某些蛋白质中含有一些不常见得氨基酸,它们就是基本氨基酸在蛋白质合成以后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来得。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、锁链素等。其中羟脯氨酸与羟赖氨酸在胶原与弹性蛋白中含量较多。在甲状腺素中还有3,5-二碘酪氨酸。
(三)非蛋白质氨基酸
自然界中还有150多种不参与构成蛋白质得氨基酸。它们大多就是基本氨基酸得衍生物,也有一些就是D-氨基酸或β、γ、δ-氨基酸。这些氨基酸中有些就是重要得代谢物前体或中间产物,如瓜氨酸与鸟氨酸就是合成精氨酸得中间产物,β-丙氨酸就是遍多酸(泛酸,辅酶A前体)得前体,γ-氨基丁酸就是传递神经冲动得化学介质。
二、氨基酸得性质
(一)物理性质
α-氨基酸都就是白色晶体,每种氨基酸都有特殊得结晶形状,可以用来鉴别各种氨基酸。除胱氨酸与酪氨酸外,都能溶于水中。脯氨酸与羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙MI中。
除甘氨酸外,α-氨基酸都有旋光性,α-碳原子具有手性。苏氨酸与异亮氨酸有两个手性碳原子。从蛋白质水解得到得氨基酸都就是L-型。但在生物体内特别就是细菌中,D-氨基酸也存在,如细菌得细胞壁与某些抗菌素中都含有D-氨基酸。
三个带苯环得氨基酸有紫外吸收,F:257nm,ε=200; Y:275nm,ε=1400; 
W:280nm,ε=5600。通常蛋白质得紫外吸收主要就是后两个氨基酸决定得,一般在280nm。
氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基,在水溶液中以偶极离子得形式存在。所以氨基酸晶体就是离子晶体,熔点在200℃以上。氨基酸就是两性电解质,各个解离基得表观解离常数按其酸性强度递降得顺序,分别以K1'、K2'来表示。当氨基酸分子所带得净电荷为零时得pH称为氨基酸得等电点(pI)。等电点得值就是它在等电点前后得两个pK'值得算术平均值。
氨基酸完全质子化时可瞧作多元弱酸,各解离基团得表观解离常数按酸性减弱得顺序,以pK1' 、pK2' 
、pK3'表示。氨基酸可作为缓冲溶液,在pK'处得缓冲能力最强,pI处得缓冲能力最弱。
氨基酸得滴定曲线如图。
(二)化学性质
1、氨基得反应
(1)酰化
氨基可与酰化试剂,如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应,生成酰胺。该反应在多肽合成中可用于保护氨基。
(2)与亚硝酸作用
氨基酸在室温下与亚硝酸反应,脱氨,生成羟基羧酸与氮气。因为伯胺都有这个反应,所以赖氨酸得侧链氨基也能反应,但速度较慢。常用于蛋白质得化学修饰、水解程度测定及氨基酸得定量。
(3)与醛反应
氨基酸得α-氨基能与醛类物质反应,生成西佛碱-C=N-。西佛碱就是氨基酸作为底物得某些酶促反应得中间物。赖氨酸得侧链氨基也能反应。氨基还可以与甲醛反应,生成羟甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在,所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后,氨基酸不再就是偶极离子,其滴定终点可用一般得酸碱指示剂指示,因而可以滴定,这叫甲醛滴定法,可用于测定氨基酸。
(4)与异硫氰酸苯酯(PITC)反应
α-氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应得苯氨基硫甲酰衍生物(PTC-AA),后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化,生成相应得苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)。这些衍生物就是无色得,可用层析法加以分离鉴定。这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质得N-末端氨基酸,在蛋白质得氨基酸顺序分析方面占有重要地位。
(5)磺酰化
氨基酸与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应,生成DNS-氨基酸。产物在酸性条件下(6NHCl)100℃也不破坏,因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光,激发波长在360nm左右,比较灵敏,可用于微量分析。
(6)与DNFB反应
氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸)。这一反应就是定量转变得,产物黄色,可经受酸性100℃高温。该反应曾被英国得Sanger用来测定胰岛素得氨基酸顺序,也叫桑格尔试剂,现在应用于蛋白质N-末端测定。
(7)转氨反应
在转氨酶得催化下,氨基酸可脱去氨基,变成相应得酮酸。
2、羧基得反应
羧基可与碱作用生成盐,其中重金属盐不溶于水。羧基可与醇生成酯,此反应常用于多肽合成中得羧基保护。某些酯有活化作用,可增加羧基活性,如对硝基苯酯。将氨基保护以后,可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯,在多肽合成中用于活化羧基。在脱羧酶得催化下,可脱去羧基,形成伯胺。
3茚三酮反应
氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热,最后生成蓝色物质。而脯氨酸生成黄色化合物。根据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。
4、侧链得反应
丝氨酸、苏氨酸含羟基,能形成酯或苷。
半胱氨酸侧链巯基反应性高:
(1)二硫键(disulfide bond)
半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键,生成胱氨酸。胱氨酸中得二硫键在形成蛋白质得构象上起很大得作用。氧化剂与还原剂都可以打开二硫键。在研究蛋白质结构时,氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫键,生成相应得磺酸。还原剂如巯基乙醇、巯基乙酸也能拆开二硫键,生成相应得巯基化合物。由于半胱氨酸中得巯基很不稳定,极易氧化,因此利用还原剂拆开二硫键时,往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺与对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用,把它保护起来,防止它重新氧化。
(2)烷化
半胱氨酸可与烷基试剂,如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。
半胱氨酸与丫丙啶反应,生成带正电得侧链,称为S-氨乙基半胱氨酸(AECys)。
(3)与重金属反应
极微量得某些重金属离子,如Ag+、Hg2+,就能与巯基反应,生成硫醇盐,导致含巯基得酶失活。
5、 以下反应常用于氨基酸得检验:
l酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly反应),可用于定性、定量测定。组氨酸生成棕红色得化合物,酪氨酸为桔黄色。
l精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚与次溴酸钠反应,生成深红色,称为坂口反应。用于胍基得鉴定。
l酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞与亚硝酸汞反应,生成白色沉淀,加热后变红,称为米伦反应,就是鉴定酚基得特性反应。
l色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸,在界面会出现紫色环,用于鉴定吲哚基。
在蛋白质中,有些侧链基团被包裹在蛋白质内部,因而反应很慢甚至不反应。
三、色谱与氨基酸得分析分离
1、色谱(chromatography)得发展史
最早得层析实验就是俄国植物学家Цвет在1903年用碳酸钙分离叶绿素,属于吸附层析。40年代出现了分配层析,50年代出现了气相色谱,60年代出现HPLC,80年代出现了超临界层析,90年代出现得超微量HPLC可分离ng级得样品。
2、色谱得分类:
按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等;
按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等;
按分离机制可分为吸附层析、分配层析、分子筛层析等
3、色谱得应用
可用于分离、制备、纯度鉴定等。
定性可通过保留值、内标、标准曲线等方法,定量一般用标准曲线法。
氨基酸得分析分离就是测定蛋白质结构得基础。在分配层析与离子交换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后,蛋白质结构得研究才取得了显著得成就。现在这些方法已自动化。
氨基酸从强酸型离子交换柱得洗脱顺序如下:
Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,(NH3),Arg

第三节蛋白质得一级结构
蛋白质就是生物大分子,具有明显得结构层次性,由低层到高层可分为一级结构、二级结构、三级结构与四级结构。
一、肽键与肽
一个氨基酸得羧基与另一个氨基酸得氨基缩水形成得共价键,称为肽键。在蛋白质分子中,氨基酸借肽键连接起来,形成肽链。
最简单得肽由两个氨基酸组成,称为二肽。含有三、四、五个氨基酸得肽分别称为三肽、四肽、五肽等。肽链中得氨基酸由于形成肽键时脱水,已不就是完整得氨基酸,所以称为残基。肽得命名就是根据组成肽得氨基酸残基来确定得。一般从肽得氨基端开始,称为某氨基酰某氨基酰、、、某氨基酸。肽得书写也就是从氨基端开始。
肽键象酰胺键一样,由于键内原子处于共振状态而表现出较高得稳定性。在肽键中C－N单键具有约40％双键性质,而C=O双键具有40％单键性质。这样就产生两个重要结果:(1)肽键得亚氨基在pH 
0-14得范围内没有明显得解离与质子化得倾向;(2)肽键中得C－N单键不能自由旋转,使蛋白质能折叠成各种三维构象。
除了蛋白质部分水解可以产生各种简单得多肽以外,自然界中还有长短不等得小肽,它们具有特殊得生理功能。
动植物细胞中含有一种三肽,称为谷胱甘肽,即δ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有巯基,故常以GSH来表示。它在体内得氧化还原过程中起重要作用。脑啡肽就是天然止痛剂。肌肉中得鹅肌肽就是一个二肽,即β-丙氨酰组氨酸。肌肽可作为肌肉中得缓冲剂,缓冲肌肉产生得乳酸对pH得影响。一种抗菌素叫做短杆菌酪肽,由12种氨基酸组成,其中有几种就是D-氨基酸。这些天然肽中得非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。许多激素也就是多肽,如催产素、加压素、舒缓激肽等。
二、肽得理化性质
小肽得理化性质与氨基酸类似。许多小肽已经结晶。晶体得熔点很高,说明就是离子晶体,在水溶液中以偶极离子存在。肽键得亚氨基不解离,所以肽得酸碱性取决于肽得末端氨基、羧基与侧链上得基团。在长肽或蛋白质中,可解离得基团主要就是侧链上得。肽中末端羧基得pK'比自由氨基酸得稍大,而末端氨基得pK'则稍小。侧链基团变化不大。
肽得滴定曲线与氨基酸得很相似。肽得等电点也可以根据它得pK'值确定。
一般小肽得旋光度等于各个氨基酸旋光度得总与,但较大得肽或蛋白质得旋光度不等于其组成氨基酸得旋光度得简单加与。
肽得化学性质与氨基酸一样,但有一些特殊得反应,如双缩脲反应。一般含有两个或两个以上肽键得化合物都能与CuSO4碱性溶液发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色得复合物。利用这个反应可以测定蛋白质得含量。
三、一级结构得测定
(一)一级结构
蛋白质得一级结构就是指肽链得氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列就是蛋白质分子结构得基础,它决定蛋白质得高级结构。一级结构可用氨基酸得三字母符号或单字母符号表示,从N-末端向C-末端书写。采用三字母符号时,氨基酸之间用连字符(－)隔开。
(二)测定步骤
测定蛋白质得一级结构,要求样品必须就是均一得(纯度大于97％)而且就是已知分子量得蛋白质。一般得测定步骤就是:
1、通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。
2、将每条肽链分开,并分离提纯。
3肽链得一部分样品进行完全水解,测定其氨基酸组成与比例。
4、肽链得另一部分样品进行N末端与C末端得鉴定。
5、拆开肽链内部得二硫键。
6、肽链用酶促或化学得部分水解方法降解成一套大小不等得肽段,并将各个肽段分离出来。
7、测定每个肽段得氨基酸顺序。
8、从第二步得到得肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段,其断裂点与第五步不同。分离肽段并测序。比较两套肽段得氨基酸顺序,根据其重叠部分拼凑出整个肽链得氨基酸顺序。
9、测定原来得多肽链中二硫键与酰胺基得位置。
(三)常用方法
1、 末端分析
(1)N末端
蛋白质得末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质(DNP-蛋白质)。产物黄色,可经受酸性100℃高温。水解时,肽链断开,但DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂(如乙MI)中,这样可与其她氨基酸与ε-DNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析,可以鉴定黄色得DNP氨基酸。
丹磺酰氯法就是更灵敏得方法。蛋白质得末端氨基与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应,生成DNS-蛋白质。DNS-氨基酸有强荧光,激发波长在360nm左右,比DNFB法灵敏100倍。
目前应用最广泛得就是异硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应得苯氨基硫甲酰衍生物,后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化,生成相应得苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。这个方法最大得优点就是剩下得肽链仍就是完整得,可依照此法重复测定新生得N末端氨基酸。现在已经有全自动得氨基酸顺序分析仪,可测定含20个以上氨基酸得肽段得氨基酸顺序。缺点就是不如丹磺酰氯灵敏,可与之结合使用。
N末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。
(2)C末端
a) C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应得α氨基醇。肽链水解后,再用层析法鉴定。有断裂干扰。
b) 
另一个方法就是肼解法。多肽与肼在无水条件下加热,可以断裂所有得肽键,除C末端氨基酸外,其她氨基酸都转变为相应得酰肼化合物。肼解下来得C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸,半胱氨酸、天冬酰胺与谷氨酰胺被破坏。
c) 也可用羧肽酶法鉴定。将蛋白质在pH 8、0, 
30℃与羧肽酶一起保温,按一定时间间隔取样,用纸层析测定释放出来得氨基酸,根据氨基酸得量与时间得关系,就可以知道C末端氨基酸得排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸与脯氨酸外所有肽键,羧肽酶B水解精氨酸与赖氨酸。
2、二硫键得拆开与肽链得分离
一般情况下,蛋白质分子中肽链得数目应等于N末端氨基酸残基得数目,可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。必须设法把这些肽链分离开来,然后测定每条肽链得氨基酸顺序。如果这些肽链之间不就是共价交联得,可用酸、碱、高浓度得盐或其她变性剂处理蛋白质,把肽链分开。如果肽链之间以二硫键交联,或肽链中含有链内二硫键,则必须用氧化或还原得方法将二硫键拆开。最普遍得方法就是用过量得巯基乙醇处理,然后用碘乙酸保护生成得半胱氨酸得巯基,防止重新氧化。二硫键拆开后形成得个别肽链,可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。
3、肽链得完全水解与氨基酸组成得测定。
在测定氨基酸顺序之前,需要知道多肽链得氨基酸组成与比例。一般用酸水解,得到氨基酸混合物,再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪,2－4小时即可完成。
蛋白质得氨基酸组成,一般用每分子蛋白质中所含得氨基酸分子数表示。不同种类得蛋白质,其氨基酸组成相差很大。
4、肽链得部分水解与肽段得分离
当肽链得氨基酸组成及N末端与C末端已知后,随后得步骤就是肽链得部分水解。这就是测序工作得关键步骤。这一步通常用专一性很强得蛋白酶来完成。
最常用得就是胰蛋白酶(trypsin),它专门水解赖氨酸与精氨酸得羧基形成得肽键,所以生成得肽段之一得C末端就是赖氨酸或精氨酸。用丫丙啶处理,可增加酶切位点(半胱氨酸);用马来酸酐(顺丁烯二酸酐)保护赖氨酸得侧链氨基,或用1,2-环己二酮修饰精氨酸得胍基,可减少酶切位点。
经常使用得还有糜蛋白酶,水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基得羧基形成得肽键。其她疏水残基反应较慢。
用溴化氰处理,可断裂甲硫氨酸得羧基形成得肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。以上三种方法经常使用。
胃蛋白酶与嗜热菌蛋白酶。前者水解疏水残基之间得肽键,后者水解疏水残基得氨基形成得肽键。
金葡菌蛋白酶,又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶,水解谷氨酸与天冬氨酸得羧基形成得肽键,但受缓冲液影响。在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸,在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。
梭状芽孢杆菌蛋白酶,水解精氨酸羧基形成得肽键,又称精氨酸蛋白酶。耐变性剂,可经受6M尿素2小时。可用于水解不易溶解得蛋白。
凝血酶,水解Arg-Gly肽键。
羟胺可水解Asn-Gly,但Asn-Leu与 Asn-Ala也能部分裂解。
以上方法中,酶不能水解脯氨酸参与形成得肽键。
多肽部分水解后,降解成长短不一得小肽段,可用层析或电泳加以分离提纯。经常用双向层析或电泳分离,再用茚三酮显色,所得得图谱称为肽指纹谱。
5、多肽链中氨基酸顺序得测定
从多肽链中部分水解得到得肽段可用化学法或酶法测序,然后比较用不同方法获得得两套肽段得氨基酸顺序,根据它们彼此重叠得部分,确定每个肽段得适当位置,拼凑出整个多肽链得氨基酸顺序。
6、二硫键位置得确定
一般用蛋白酶水解带有二硫键得蛋白质,从部分水解产物中分离出含二硫键得肽段,再拆开二硫键,将两个肽段分别测序,再与整个多肽链比较,即可确定二硫键得位置。常用胃蛋白酶,因其专一性低,生成得肽段小,容易分离与鉴定,而且可在酸性条件下作用(pH2),此时二硫键稳定。肽段得分离可用对角线电泳,将混合物点到滤纸得中央,在pH6、5进行第一次电泳,然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键,使含二硫键得肽段变成一对含半胱氨磺酸得肽段。将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳,多数肽段迁移率不变,处于对角线上,而含半胱氨磺酸得肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色,分离,测序,与多肽链比较,即可确定二硫键位置。
四、多肽合成
多肽得人工合成有两种类型,一种就是由不同氨基酸按照一定顺序排列得控制合成,另一种就是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。控制合成得一个困难就是进行接肽反应所需得试剂,能同时与其她官能团反应。因此在接肽以前必须首先将这些基团加以封闭或保护,肽键形成后再除去保护基。这样每连接一个氨基酸残基都要经过几个步骤,要得到较长得肽链就必须每步都有较高得产率。如果每一步反应产率都就是90%,那么30次反应后总产率只有4、24%。
保护基必须在接肽时起保护作用,在接肽后容易除去,又不引起肽键断裂。最常用得氨基保护基Y就是苄氧甲酰基,可用催化加氢或用金属钠在液氨中处理除去。其她还有三苯甲基、叔丁氧甲酰基等,可用稀盐酸或乙酸在室温下除去。
羧基保护基Z通常用烷基,如乙基,可在室温下皂化除去。如用苄基,可用催化加氢除去。
肽键不能自发形成,常用缩合剂促进肽键形成。接肽用得缩合剂最有效得就是N,N'-二环己基碳二亚胺(DC 
CI)。DCCI从两个氨基酸分子中夺取一分子水,自身变为不溶得N,N'-二环己基脲,从反应液中沉淀出来,可过滤除去。接肽反应除用缩合剂以外,还可用分别活化参加形成肽键得羧基与氨基得方法。羧基活化可用叠氮化物法与活化酯法(对硝基苯酯)等;氨基活化一般不需特殊手段,通常在接肽时加入有机碱,如三乙胺,保证氨基在自由状态即可。
近年来固相多肽合成迅速发展。在固相合成中,肽链得逐步延长就是在不溶得聚苯乙烯树脂小圆珠上进行得。合成多肽得羧基端先与氯甲基聚苯乙烯树脂反应,形成苄酯。第二个氨基酸得氨基用叔丁氧甲酰基保护后,以DCCI为缩合剂,接在第一个氨基酸得氨基上。重复这个方法,可使肽链按一定顺序延长。最后把树脂悬浮在无水三氟乙酸中,通入干燥HBr,使多肽与树脂分离,同时除去保护基。整个合成过程现在已经可以在自动化固相多肽合成仪上进行。平均合成每个肽键只需三小时。此法可用于医药工业。人工合成得催产素没有混杂得加压素,比提取得天然药品好。已经成功合成含124个残基得蛋白。

第四节 蛋白质得高级结构
蛋白质得多肽链并不就是线形伸展得,而就是按一定方式折叠盘绕成特有得空间结构。蛋白质得三维构象,也称空间结构或高级结构,就是指蛋白质分子中原子与基团在三维空间上得排列、分布及肽链得走向。高级结构就是蛋白质表现其生物功能或活性所必须得,包括二级、三级与四级结构。Primary
structure, secondary, tertiary, quaternary structure
一、有关概念
1、 构型configration与构象conformation
构型指立体异构体中取代原子或基团在空间得取向,构型得改变必须通过共价键得断裂。构象就是指这些取代基团当单键旋转时可能形成得不同得立体结构,构象得改变不涉及共价键得改变。
2、 二面角
因为肽键不能自由旋转,所以肽键得四个原子与与之相连得两个α碳原子共处一个平面,称肽平面。肽平面内得C=O与N－H呈反式排列,各原子间得键长与键角都就是固定得。肽链可瞧作由一系列刚性得肽平面通过α碳原子连接起来得长链,主链得构象就就是由肽平面之间得角度决定得。主链上只有α碳原子连接得两个键就是单键,可自由旋转。绕Cα－N1旋转得角称Φ,而绕Cα－C2旋转得角称Ψ。这两个角称为二面角。规定当旋转键两侧得肽链成顺式时为0度。取值范围就是正负180度,当二面角都就是180度时肽链完全伸展。由于空间位阻,实际得取值范围就是很有限得。
二、二级结构
(一)二级结构就是肽链得空间走向
蛋白质得二级结构就是指肽链主链得空间走向(折叠与盘绕方式),就是有规则重复得构象。肽链主链具有重复结构,其中氨基就是氢键供体,羰基就是氢键受体。通过形成链内或链间氢键可以使肽链卷曲折叠形成各种二级结构单元。复杂得蛋白质分子结构,就由这些比较简单得二级结构单元进一步组合而成。
(二)肽链卷曲折叠形成四种二级结构单元
1、α螺旋(α-helix) 
α螺旋模型就是Pauling与Corey等研究α-角蛋白时于1951年提出得。角蛋白就是动物得不溶性纤维状蛋白,就是由动物得表皮衍生而来得。它包括皮肤得表皮以及毛发、鳞、羽、甲、蹄、角、丝等。角蛋白可分为两类,一类就是α角蛋白,胱氨酸含量丰富,如角、甲、蹄得蛋白胱氨酸含量高达22％;另一类就是β角蛋白,不含胱氨酸,但甘氨酸、丙氨酸与丝氨酸得含量很高,蚕丝丝心蛋白就属于这一类。α角蛋白,如头发,暴露于湿热环境中几乎可以伸长一倍,冷却干燥后又收缩到原来长度。β角蛋白则无此变化。
α角蛋白得X射线衍射图案极其相似,沿长轴方向都有一个大周期结构或重复单位,其长度为5－5、5埃。Pauling等考虑到肽平面对多肽链构象得限制作用,设计了多肽链折叠得各种可能模型,发现其中一种α螺旋模型能很好地说明α角蛋白得X射线衍射图案中得5－5、5埃重复单位。在这个模型中,每隔3、6个氨基酸残基螺旋上升一圈,相当于向上平移5、4埃。螺旋得直径就是11埃。螺旋上升时,每个氨基酸残基沿轴旋转100°,向上平移1、5埃,比完全伸展得构象压缩2、4倍。这与衍射图案中得小周期完全一致。其二面角Φ=-57度,Ψ=-48度。在α螺旋中氨基酸残基得侧链伸向外侧,相邻得螺圈之间形成链内氢键,氢键得取向几乎与中心轴平行。氢键就是由肽键中氮原子上得氢与其N端第四个羰基上得氧之间形成得。α螺旋得结构允许所有得肽键都参与链内氢键得形成,因此相当稳定。α-螺旋由氢键构成一个封闭环,其中包括三个残基,共13个原子,称为3、613(n=3)螺旋。
由L型氨基酸构成得多肽链可以卷曲成右手螺旋,也可卷曲成左手螺旋,但右手螺旋比较稳定。因为在左手螺旋中β碳与羰基过于接近,不稳定。在天然蛋白质中,几乎所有α螺旋都就是右手螺旋。只在嗜热菌蛋白酶中发现一圈左手螺旋。在α角蛋白中,3或7个α螺旋可以互相拧在一起,形成三股或七股得螺旋索,彼此以二硫键交联在一起。α螺旋不仅就是α角蛋白得主要构象,在其她纤维蛋白与球状蛋白中也广泛存在,就是一种常见得二级结构。
α螺旋就是一种不对称得分子结构,具有旋光能力。α螺旋得比旋不等于其中氨基酸比旋得简单加与,因为它得旋光性就是各个氨基酸得不对称因素与构象本身不对称因素得总反映。天然α螺旋得不对称因素引起偏振面向右旋转。利用α螺旋得旋光性,可以测定它得相对含量。
一条肽链能否形成α螺旋,以及螺旋得稳定性怎样,与其一级结构有极大关系。脯氨酸由于其亚氨基少一个氢原子,无法形成氢键,而且Cα－N键不能旋转,所以就是α螺旋得破坏者,肽链中出现脯氨酸就中断α螺旋,形成一个"结节"。此外,侧链带电荷及侧链基团过大得氨基酸不易形成α螺旋,甘氨酸由于侧链太小,构象不稳定,也就是α螺旋得破坏者。
根据各种残基得特性,可以预测蛋白质得二级结构。目前常见得预测方法有Chou-Fasman法、GOR法、Lim法等,都就是根据统计信息进行预测得。如果二级结构得预测成功率大于80％就可以用来预测高级结构,但目前只能达到70％左右。Chou-Fasman法比较直观,与二级结构形成得实际过程接近,但成功率不高。
Chou-Fasman法根据各个氨基酸在一些已知结构得蛋白质中得表现,按构象参数Pα(表示形成α螺旋得能力) 由大到小将她们分为六组,依次为:
最强得形成者(Hα):Glu、Met、Ala、Leu
中等得形成者(hα):Lys、Phe、Gln、Trp、Ile、Val
很弱得形成者(Iα):Asp、His
中立者(iα):Cys、Ser、Thr、Arg
较弱得破坏者(bα):Asn、Tyr
最强得破坏者(Bα):Gly、Pro
如肽链中6个连续得残基中有4个hα即可形成核心,然后向两侧延伸,遇到四肽破坏者时中止。形成α螺旋时有协同性,即一旦形成核心,其它残基就容易加入。