第三章转基因动物技术与药物生产.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程技术,按照人们的意志,通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基因组内,使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术。,特点:,基因体外重组,不受生物种类的限制,精确细致地控制,外源目的基因的制备，外源目的基因有效地导入生殖,细胞或胚胎干细胞；,选择获得携有目的基因的细胞，选择合适的体外培养,系统和宿主动物；,转基因细胞胚胎发育及鉴定；,筛选所得的转基因动物品系。,关键技术包括：,6.1,转基因动物的原理和方法,目的基因的克隆,（,1,）质粒载体,基因克隆的载体,（,2,）病毒类载体（,噬菌体载体等）,（,3,）粘粒载体,（,4,）人工染色体,6.2,转基因技术,质粒载体,质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。质粒DNA不但能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可复制的穿梭质粒，因此以质粒为载体的基因克隆方法被广泛使用。,6.2,转基因技术,噬菌体是一种双链,DNA,噬菌体，基因组约有,50kb,，在,噬菌体颗粒中分离出来的,DNA,为线性双链分子，在分子两端各有,12,个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。,噬菌体功能相关基因成簇排列在基因组上，中间部分,(,约占,30,),为非裂解生长所必须，根据这一特性，可用其他外源,DNA,片段插入或取代该区域，而对噬菌体的感染和生长不会造成严重影响。这是,噬菌体成为重要的、有价值的基因克隆载体的基础所在。构建的重组,噬菌体分子，其总长不得超过野生型,DNA,的,105,，不能短于,75,。,病毒类载体（,噬菌体载体等）,6.2,转基因技术,粘粒,(cosmid),是由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成，由于,噬菌体载体容量仍然受到一定限制，最大插入片段不能超过,23kb,。,1978,年勘,Collis,和比,Hohn,发展了这类质粒与噬菌体联合的新载体,粘粒，其基因组一般由以下几部分组成：,质粒复制起始位点，,1,个或多个限制性内切酶位点，抗药性标记和带有粘性末端的,DNA,片段。粘粒载体大小为,46kb,，而插入片段为,2945kb,。,粘粒载体,6.2,转基因技术,人工染色体,人工酵母染色体,(Yeast Artificial Chromosome,YAC),人工细菌染色体,(Bacterial Artificial Chromosome,BAC),6.2,转基因技术,染色体DNA的三种功能元件（functional elements）,自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA sequence,ARS),着丝粒DNA序列(centromere DNA sequence,CEN),端粒DNA序列(telomere DNA sequence,TEL),6.2,转基因技术,人工酵母染色体法,YAC,能克隆百万对碱基的大片段,DNA,A.,阳性,ES,细胞在,YAC,转染及体外筛选,囊胚腔注射,B.YAC,的原核微注射。,技术途径,：,6.2,转基因技术,优点,：,A.保证大片段DNA的完整性,B.提高较长外源片段在动物转基因时的整合率,C.保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性,因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。,YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。,6.2,转基因技术,人工酵母染色体（,YAC,）的制备,6.2,转基因技术,6.2,转基因技术,6.2,转基因技术,细胞接受外源的方式,6.2,转基因技术,细胞转染外源基因的方法：,物理方法,化学方法,生物学方法,6.2,转基因技术,物理方法,电穿孔法,微注射法,裸露,DNA,直接注射法,6.2,转基因技术,电穿孔法,6.2,转基因技术,电穿孔法示意图,6.2,转基因技术,微注射法,6.2,转基因技术,微注射法示意图,6.2,转基因技术,6.2,转基因技术,裸露,DNA,直接注射法,将裸露,DNA,直接注射到组织中,DNA,有可能被细胞摄入这是最简单的基因转移方法,但是转移效率很低,6.2,转基因技术,化学方法,主要原理是通过改变细胞膜的通透性或者增加,DNA,与细胞的吸附而实现基因的转移,6.2,转基因技术,DEAE-葡聚糖法,磷酸钙-DNA共沉淀法,脂质体载体包埋法,6.2,转基因技术,DEAE-,葡聚糖法,最早的动物细胞转染方法。,将外源,DNA,片段与,DEAE,葡聚糖等高分子碳水化合物混合，,DNA,链上带负电的磷酸骨架便被吸附于,DEAE,的正电荷基团上，从而形成,DNA,大颗粒。后者黏附于受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。,该方法的转化率较低。,6.2,转基因技术,磷酸钙,-DNA,共沉淀法,是受二价金属离子能促进细菌吸收外源,DNA,而来,.,当核酸以磷酸钙,-DNA,共沉淀物的形式存在时,细胞摄取,DNA,的能力显著增加。,6.2,转基因技术,磷酸钙,-DNA,共沉淀法图示,6.2,转基因技术,脂质体载体包埋法,6.2,转基因技术,脂质体载体包埋法图示,6.2,转基因技术,生物学方法,基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为载体。目前常用的病毒载体包括,DNA,病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体等）、反转录病毒载体等。,6.2,转基因技术,腺病毒载体,运载DNA片段较大,安全性好,宿主范围广,对受体细胞分裂周期要求不严,外源基因表达高效,6.2,转基因技术,反转录病毒载体,可获得稳定有效的转染,可用于不易转化的细胞,但有免疫反应,转染能力有限,6.2,转基因技术,反转录病毒载体图示,6.2,转基因技术,转染细胞的鉴定,载体的抗药性选择,DNA,分子杂交法,6.2,转基因技术,制备转基因动物的方法,转基因动物研究的核心技术是成功地把目的基因转入动物早期胚胎细胞中。目前，研究生产转基因动物的主要方法有基因显微注射法，胚胎干细胞移植法，反转录病毒感染法和精子载体导入法等。,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,基因显微注射法,6.3,转基因动物,显微注射,DNA(,目的基因,),的构型、末端结构、长度与浓度、克隆载体和溶解,DNA,的缓冲液对目的基因的转移、整合及表达都有一定影响。,显微注射,DNA,的制备与纯化,6.3,转基因动物,DNA构型和末端结构：,线状与环状DNA均可用于转基因研究。,线状DNA的末端结构差异(平末端、粘性末端)对整合效率与整合分子的结构影响不大。转移的DNA在染色体上的整合大多呈首尾相连的多拷贝，不同构型与末端间无明显差异。,6.3,转基因动物,载体：,原核克隆载体(如质粒)序列不影响携带基因的整合效率，但影响基因在转基因动物中的表达。注射前去除载体的基因，其表达水平显著高于保留载体的基因，且前者具有较好的重复性。对某些基因(如珠蛋白基因)，只有注射前去除载体才能得到组织特异性表达。,6.3,转基因动物,留在核内的DNA溶液体积不明。,DNA浓度易掌握，1ug/ml-3ug/ml,DNA,体积与浓度：,6.3,转基因动物,溶解DNA的缓冲液：,一般含5-10mmol/ml Tris(pH7.4)与0.1-0.25mmol/L EDTA,EDTA浓度需适中,6.3,转基因动物,鼠的准备与要求,母鼠,卵供体和假孕母鼠,公鼠,正常、结扎,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,卵供体母鼠：,超排卵供体46周鼠,34周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂。,5周以后母鼠产卵逐渐减少。超排卵较好的母鼠每只每次产2030个卵。,6.3,转基因动物,公鼠,性成熟约在68周，不同种系公鼠性维持时间不一，一般12年，但纯系公鼠只可使用810个月。每个公鼠需单笼饲养以免咬伤，饲养于2周后方可与超排卵母鼠交配。每个母鼠与1个公鼠交配次日上午检查精栓，如两次以上都不能使母鼠有精栓，则需更换公鼠。为保证有足够的受精卵，公鼠最好每周只交配1次。,6.3,转基因动物,假孕母鼠,母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后的养母。这种母鼠在6周至5个月较适宜，体重最好大于20克，已产过仔并成功抚育过仔鼠的假孕母鼠最理想。,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,超排卵与取卵,46,周母鼠在明暗循环的动物房内饲养,35,天，即可作超排卵，母鼠的性成熟程度是影响其超排卵的主要因素，一般在,35,周，卵泡成熟周期已开始，对卵泡刺激素,(FSH),有反应的卵泡数达峰值。母鼠的不同种系其超排卵数也不同，这取决于其对,FSH,和,LH(,黄体生成素,),的敏感程度，高敏种系每只鼠超排卵数可达,4060,个，低敏种系不足,15,个。,取卵：,取卵全过程应尽快完成,(1,小时内,),以减少暴露状态给卵带来的不利因素。,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,需,8,周以上，无种系要求。在正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要先后使,3,只母鼠产生精栓且所有产生精栓的母鼠均未怀孕，然后才可用于与母鼠交配，产生假孕母鼠。,结扎公鼠,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,显微注射,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,卵的转移,6.3,转基因动物,转基因鼠的获得,胚胎干细胞方法,反转录病毒感染法,精子载体法,6.3,转基因动物,胚胎干细胞,(embryonic stem cell,，,ES),是从早期胚胎内细胞团,(ICM),分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能细胞。,胚胎干细胞方法,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,利用反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞,DNA,上的高度整合特性，可以大大提高基因转移的效率。因此可以利用反转录病毒作为目的基因的载体，通过感染实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交，筛选即可获得转基因动物,反转录病毒感染法,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,精子吸附,DNA,就使目的基因进入精细胞，再通过受精作用把目的基因传给子代动物，获得转基因动物。外源目的基因进入精细胞可通过与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法。,精子载体法,精子吸附,DNA,的方法,6.3,转基因动物,受精技术,精子在吸附外源性,DNA,后，即可以利用其进行受精，受精的方法及途径随着精子的处理方式及卵来源不同而有所不同,6.3,转基因动物,人工授精,壶腹部手术授精,体外授精,6.3,转基因动物,其他方法,原始生殖细胞技术,体细胞核移植技术,逆转录病毒载体注射M期的卵母细胞,精子头与外源DNA合并注射卵母细胞,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,6.3,转基因动物,转基因动物鉴定技术,分子杂交,斑点杂交,聚合酶链式反应,(PCR),原位杂交,6.3,转基因动物,转基因动物的应用,研究基因的结构与功能,研究基因的组织特异性表达,研究发育相关基因的表达与调控,克隆在发育中起重要作用的基因,基因多级调节系统的研究,细胞功能的研究,转基因动物在生命科学基础研究中的应用,6.3,转基因动物,快速生长与肉质改良,增强抗病性,增加羊毛产量和性能,抗冻品种培育,优良动物品种育种,在农牧业生产上的应用,6.3,转基因动物,研究病毒性疾病,研究建立人类疾病的转基因动物模型,转基因动物与基因治疗,生产天然活性药物蛋白,转基因动物在医药研究领域中的应用,6.3,转基因动物,在异种器官移植中的应用,建立异种抗原缺失或者表达水平低下的转基因猪,建立,HLA,转基因猪,建立人补体调节蛋白,CD55,CD59,等的转基因猪,6.3,转基因动物,转基因动物应用面临的问题,目的基因整合与表达的效率较低，或者引起宿主细胞基因突变。,转基因动物的负面效应。,研究费用高，需要相当的财力支持,6.3,转基因动物,转基因生物反应器类型,转基因微生物反应器,转基因植物反应器,转基因动物反应器,动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器,其他生物反应器,6.4,转基因生物反应器,转基因动物反应器,从,1987,年，,Gordon,等，转基因小鼠,组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（,tPA,）,1998,年，,3,种转基因技术生产的重组蛋白进入临床试验,6.4,转基因生物反应器,抗凝血药物,抗凝血酶,:,第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶,，将半乳糖,-,酪蛋白的启动子和含抗凝血酶,基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可达,7g/L,。目前该蛋白正用于冠状动脉旁路手术患者的二期临床验证。,6.4,转基因生物反应器,肺气肿治疗药物,1-,抗胰蛋白酶,:,可抑制肺气肿释放的蛋白酶对肺组织的破坏,6.4,转基因生物反应器,应用转基因植物生产的药物,6.4,转基因生物反应器,动物乳腺生物反应器的制备,表达载体的构建,目的基因的选择,体外重组,基因转导,胚胎移植,鉴定,6.4,转基因生物反应器,转基因牛,乳腺生物反应器制备流程,6.4,转基因生物反应器,不同转基因生物反应器的特点比较,6.4,转基因生物反应器,动物乳腺生物反应器的应用,改良乳汁品质,药用蛋白,6.4,转基因生物反应器,动物乳腺生物反应器的优点,产品质量稳定,产品成本低,研制开发周期短,无污染,经济效益显著,6.4,转基因生物反应器,动物乳腺生物反应器存在的问题,外源基因在动物体内的位点整合问题,乳蛋白基因表达组织特异性问题、,目的蛋白的翻译后修饰问题,转基因表达产物的分离和纯化问题,转基因的技术与方法问题,伦理道德问题,6.4,转基因生物反应器,