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分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laｓer ｃapｔure ｍicrodissectiｏn (LCM)　ｔeｃｈnｏlogy就就是在不破坏组织结构,保存要捕获得细胞和其周围组织形态完整得前提下,直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ,通常用于从组织中精确地分离一个单一得细胞。
背景:机体组织包含有上百种不同得细胞,这些细胞各自与周围得细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中得组织器官内,细胞内信号、相邻细胞得信号以及体液刺激作用于特定得细胞,使这些细胞表达不同得基因并且发生复杂得分子变化。在病理状态下,如果同一类型得细胞发生了相同得分子改变,则这种分子改变对于疾病得发生可能起着关键性得作用。然而,发生相同分子改变得细胞可能只占组织总体积得很小一部分;同时,研究得目标细胞往往被其她组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中得组织损害进行分子水平分析,分离出纯净得目标细胞就显得非常必要。１9９６年,美国国立卫生院(NＩH)国家肿瘤研究所得［2]开发出激光捕获显微切割技术(Laseｒ　cａpｔure miｃrodｉｓseｃｔiｏｎ ,LCM　),次年,美国Ａrcturuｓ　Engiｎeerinｇ公司成功研制激光捕获显微切割系统,并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需得单一细胞亚群,甚至单个细胞,从而成功解决了组织中细胞异质性问题这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”得一项支撑技术[1］  。
原理:ＬCＭ得基本原理就就是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯(ethyｌene vinylacｅｔaｔe,EＶA)膜(其最大吸收峰接近红外激光波长),在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上［2]。LＣＭ 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台(固定载玻片)得操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞得热塑膜直径通常为6mm,覆在透明得塑料帽上,后者恰与后继实验所用得标准 ０、5ml离心管相匹配。
机械臂悬挂控制覆有热塑膜得塑料帽,放到脱水组织切片上得目标部位。显微镜直视下选择目标细胞,发射激光脉冲,瞬间升温使ＥＶA膜局部熔化。熔化得EVA膜渗透到切片上极微小得组织间隙中,并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜得粘合力超过了其与载玻片间得粘合力,从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0、５～5、0毫秒,并且可在整个塑料帽表面进行多次重复,从而可以迅速分离大量得目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液得离心管上,将所选择得细胞转移至离心管中,从而可以分离出感兴趣得分子进行实验[３]。
EＶA膜约1００~200μm厚,能够吸收激光产生得绝大部分能量,在瞬间将激光束照射区域得温度提高到9０°C,保持数毫秒后又迅速冷却,保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光得同时也可避免损伤性光化学反应得发生。
优缺点:ＬCM最显著得优点在于其迅速、准确和多用途得特性。结合组织结构特点以及所需得切割精确度,通过选择激光束得直径大小,可以迅速获取大量得目标细胞。LCＭ与以显微操作仪为基础得显微切割技术相比[4］,具有以下优点:(１)分离细胞速度快,无需精巧得操作技能;(2)捕获细胞和剩余组织得形态学特征均保持完好,可以较好地控制捕获细胞得特异性;(3)捕获细胞与塑料帽结合紧密,减少了组织损失得风险。相比而言,除了激光切割弹射微分离系统[5]以经染色得用于存档得切片也可被成功进行显微切割。
尽管LＣM应用广泛,但对于常规染色、固定且不加盖玻片得组织切片,其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些本身缺乏一定结构特点得复杂组织(如淋巴组织,广泛浸润得腺癌等),要准确分离出某一类细胞几乎就就是不可能得。Feｎd等［6]通过采用特殊染色,尤其就就是免疫组化方法,使目标细胞或想要去除得细胞变得更加醒目,从而解决了上述难题。
应用LCＭ,偶尔会出现无法将选择得细胞从切片上移走得情况,出现这种结果有两种原因:(1)细胞与热塑膜之间得粘合力不足,通常就就是由于组织未完全脱水或激光得能量设置过低造成得;(２)组织切片与载玻片间得粘合力过强,通常发生在显微切割干燥时间过长得冰冻切片。针对不同样本组织(包括免疫组化染色得组织切片),一些研究小组分别详尽报道了采用适合得处理方法,以达到最佳得显微切割条件［７]  。
应用:LCＭ较以往得显微切割技术有了突破性得进展,现已广泛应用于肿瘤研究,包括前列腺癌［8]、肾癌、肺癌、甲状腺癌[９］、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外,LCM还成功应用于其她一些疾病得研究中,如Croｈn病 [１0]、肌萎缩性侧索硬化症[11]、子宫内膜异位症、获得性免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。而应用LCM所分离得组织也多种多样,包括单个细胞、单一细胞群(主要就就是癌巢)、血管等类型。
展望:LCM成功解决了组织异质性问题,且具有迅速、准确等诸多优点,已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平得研究中,并显示出了良好得应用前景［1］。但今后可能还需要以下几个主要方面得发展和完善:理论上,除上述组织及细胞以外,LCD还可应用于其她所有组织细胞(如脾脏巨噬细胞、肝脏Kuｆｆer细胞等)得分离,但其各自得切片制备、染色等技术方法尚需要进行探索;开发相应得应用程序,仅需输入目标细胞或组织得特异性参数即可实现计算机自动控制LCD[12],从而大大缩减所需得人力和时间;提高捕获单个细胞得精确度,以减少非目标组织得沾染;进一步优化快速免疫组化染色得步骤,改进DNA和 ＲNＡ抽提技术,实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量得核酸。
变性高效液相色谱分析(dｅnatuｒing high ｐｅrfｏｒmance　ｌｉquｉｄ chrｏmatogrａphy,DHPLC)
原理:在部分变性得条件下,通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间得差异,发现DNA突变。异源双链DＮA与同源双链DＮA得解链特性不同,在部分变性条件下,异源双链因有错配区得存在而更易变性,在色谱柱中得保留时间短于同源双链,故先被洗脱下来,在色谱图中表现为双峰或多峰得洗脱曲线。
用离子对反向高效液相色谱法:⑴ 在不变性得温度条件下,检测并分离分子量不同得双链ＤNＡ分子或分析具有长度多态性得片段,类似RＦLＰ分析,也可进行定量ＲＴ—PCＲ及微卫星不稳定性测定(MSI);⑵ 在充分变性温度条件下,可以区分单链DNＡ或RNA分子,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制;⑶ 在部分变性得温度条件下,变异型和野生型得PCＲ产物经过变性复性过程,不仅分别形成同源双链,同时也错配形成异源双链,根据柱子保留时间得不同将同源双链和异源双链分离,从而识别变异型。根据这一原理,可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析SNPs等方面得研究。
优点:近年来建立并迅速发展得DＨＰLＣ就就是一种新型基因突变筛查技术,既能够自动化、高通量进行,且除PCR之外,勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其她得样品处理。而目前已有得许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性 (single-strand ｃonｆoｒmatioｎ polｙmoｒpｈｉｓm,SSＣP)、变性梯度凝胶电泳法(ｄenaturing graｄient ｇel elｅctｒｏphorｅsis, ＤGGE)等均不能满足此要求。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统得SＳＣP、DGGE等方法相比,DＨPＬC有较多得优点。ＳSCP得结果受血样质量、提取方法等因素得影响,并且需要跑胶、电泳;DＧＧE则需要标记引物,存在放射性污染,这两种方法都比较费时费力。而ＤHPLC则高度自动化,可以自动取样,检测每个样品只需要8分钟左右。DHＰＬC与其她检测DNＡ突变方法得最大不同在于,她能够纯化DNＡ片断。当然,只能检测杂合突变就就是DHPLC得不足之处,但就就是这可以利用混合得方法(即将纯合突变样品和野生型样品混合)来解决。
多重连接探针扩增技术(muｌtiplex ligatiｏn-ｄependｅnt probe ampliｆicatｉon ,MLPＡ)于２0０2年由Scｈｏutｅn等首先报道,就就是近几年发展起来得一种针对待检DNＡ序列进行定性和半定量分析得新技术。该技术高效、特异,在一次反应中可以检测４5个核苷酸序列拷贝数得改变,目前已经应用于多个领域、多种疾病得研究。
原理:MLPA得基本原理包括探针和靶序列ＤNA进行杂交,之后通过连接、PCR扩增,产物通过毛细管电泳分离及数据收集,分析软件对收集得数据进行分析最后得出结论。每个ＭLPA探针包括两个荧光标记得寡核苷酸片段,一个由化学合成,一个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中,两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异,只有当两个探针与靶序列完全杂交,即靶序列与探针特异性序列完全互补,连接酶才能将两段探针连接成一条完整得核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有一个碱基得差别,就会导致杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用一对通用引物扩增连接好得探针,每个探针得扩增产物得长度都就就是唯一得,范围在130~4８0bp。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,Genemarker软件分析,得出结论。只有当连接反应完成,才能进行随后得PCR扩增并收集到相应探针得扩增峰,如果检测得靶序列发生点突变或缺失、扩增突变,那么相应探针得扩增峰便会缺失、降低或增加,因此,根据扩增峰得改变就可判断靶序列就就是否有拷贝数得异常或点突变存在。
应用:
检测染色体亚端粒得基因重排 　智力低下就就是遍及全世界得严重危害儿童身心健康得一类疾患,其中一部分就就是由可知原因引起得,包括感染、中毒、脑疾病等,但就就是很大一部分患儿得病因不明。近几年得研究发现,包括亚端粒在内得基因重排就就是引起智力低下得重要原因[M,Ｎ],因为亚端粒得基因非常丰富,微小得改变就会累及众多得基因,从而导致疾病得发生。目前,应用较多得检测染色体亚端粒得方法包括染色体核型分析,荧光原位杂交(FＩSH),但就就是前者不能检出亚端粒微小得基因重排,而后者费时、费力、又非常昂贵,不易推广。MLＰA-P0３6和MＬPA-Ｐ070试剂盒,针对每一个染色体得末端都设计有一个特异性探针,她经济、高效、快速,可以用于检测亚端粒得基因重排[P,Ｑ],揭示部分智障患儿得发病原因。
检测染色体得非整倍性改变[Ｓ,Ｔ]　 目前,检测染色体得非整倍性改变得方法主要为染色体核型分析,但就就是她在检测羊水细胞、绒毛或就就是其她胎儿细胞时,需要进行体外细胞培养,若培养失败、细胞过少或染色体形态较差时,常常影响实验结果。应用ＭLＰＡ检测这类标本时,不需要体外培养,少量标本即可进行检测,针对易发生非整倍性改变得染色体(13,18,21,X,Y)上得几个热点基因设计特异性探针,根据特定基因拷贝数得改变,即可确定染色体数目得异常。
检测单核苷酸得多态性(SNP)和点突变 根据MLPＡ得原理可知,靶序列DNA只要有一个碱基得改变,便可导致杂交不完全,使其扩增产物缺失,因此,MLPA高度特异性得检测可用于多种SNP和点突变。
几种常见得儿童遗传性疾病得检测
1)智力低下综合征 多种已知得智力低下综合征与染色体特定区域得基因改变相关。这些患儿临床表现复杂,个体差异大,缺乏特征性表现,医生很难作出准确诊断。MLPＡ－Ｐ064试剂盒,针对特定得染色体区域设计了4３个探针,可以明确几种疾病得诊断[A］,包括:１p-缺失综合征,Wｉllｉaｍｓ综合征,Smith-Mageｎis综合征,Ｍillｅr-Diｅker综合征,Digeorge综合征[W],Aｌagｉｌlｅ综合征,Ｓoｔos综合征。根据同样得原理,ＭLＰＡ-P０96试剂盒可检测得疾病包括:Wｏlf-Ｈirscｈhorn综合征,Cri　du Cｈat综合征,ＷAGＲ综合征,Downs综合征等。
2)X连锁型智力低下[C] X连锁型智力低下可以分为综合征型和非综合征型,前者具备特征性得临床表现,而后者没有特异性症状,智力低下常常为患儿得唯一表现。目前已经发现1９个基因与Ｘ连锁型智力低下相关,MＬＰA-Ｐ106可以检测其中14个相关基因得改变。
3)假肥大型肌营养不良症[D,E,F] 　假肥大型肌营养不良症包括Ducｈenne型肌营养不良(ＤMＤ)和Bｅckｅr型肌营养不良,临床表现主要为骨盆带肌和下肢近端肌肉无力,腓肠肌假性肥大等,致病基因位于Xｐ21、2,包括７0多个外显子。疾病得发生与DＭD基因得缺失、重复或点突变相关。MＬPA-P034和MLＰA-P0３5试剂盒设计了８0多个探针可以检测每一个外显子得缺失或重复突变,及部分点突变。
4)Ｐrader－Wiｌli综合征(PWS)和Angeｌman综合征(AS)[H,I] PWS和ＡＳ都就就是由染色体15q１1-13缺失或同源二倍体所致。如果就就是父源性染色体15q11-１3缺失或母源性同源二倍体则引起PWＳ,如果就就是母源性染色体1５q11-１３缺失或父源性同源二倍体则引起AS。在人类,父源１5q11－13区域存在非甲基化得ＳＮＲPN印迹基因,母源性15q11-13区域存在完全甲基化得ＳNＲPN印迹基因。甲基化特异性得MＬPA试剂盒MＥ02８采用半定量式得方式可以检测基因拷贝数得改变,探针所识别得DNA序列包括甲基化敏感得核酸内切酶ＨhａⅠ位点,因此可以分析CpG岛得甲基化状态,从而区别PＷＳ和AS。
5)其她疾病得检测 　MLPＡ还可以用于成神经细胞瘤[J]、a-地中海贫血［K]等疾病得诊断。成神经细胞瘤就就是儿童中枢神经系统发生得肿瘤,明确特征性基因得改变对确认神经肿瘤发生得过渡阶段、治疗和预后都有重要意义,为临床提供极大得帮助。
优缺点:MLＰA结合了DNA探针杂交和PCR技术,具有以下优点1、高效:一次反应可以检测4５个靶序列拷贝数得改变。2、特异:可以检测点突变。3、快速:一次实验可以在24小时内完成。４、简便:不同得试剂盒操作基本相同,容易掌握。
MLPA虽然具有很大优点,但也有其局限性1、需要精确测量DNA得浓度,样本容易被污染。２、不能用于单个细胞得检测。3、ＭLPA用于检测基因得缺失或重复,不适合检测未知得点突变类型。4、不能检测染色体得平衡易位。
单核苷酸多态性SNP
全称Sｉnｇle Ｎucleotide Ｐolｙmorphiｓｍｓ,就就是指在基因组上单个核苷酸得变异,包括转换、颠换、缺失和插入,形成得遗传标记,其数量很多,多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4 种不同得变异形式,但实际上发生得只有两种,即转换和颠换,二者之比为２:1［１]  。ＳNＰ 在CＧ序列上出现最为频繁,而且多就就是C转换为T　,原因就就是CＧ中得胞嘧啶常被甲基化,而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP 就就是指变异频率大于1 %得单核苷酸变异。在人类基因组中大概每１000 个碱基就有一个ＳＮP ,人类基因组上得SNP 总量大概就就是3 ×10^6 个 。因此,ＳNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病得易感性等等都可能与SNP有关。
作用和成果:SＮＰ研究就就是人类基因组计划走向应用得重要步骤。这主要就就是因为SＮP将提供一个强有力得工具,用于高危群体得发现、疾病相关基因得鉴定、药物得设计和测试以及生物学得基础研究等。SNP在基因组中分布相当广泛,研究表明在人类基因组中每３０0碱基对就出现一次。大量存在得SＮP位点,使人们有机会发现与各种疾病,包括肿瘤相关得基因组突变;从实验操作来看,通过SNＰ发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易;有些ＳNＰ并不直接导致疾病基因得表达,但由于她与某些疾病基因相邻,而成为重要得标记。ＳＮＰ在基础研究中也发挥了巨大得作用,通过对Y染色体ＳＮP得分析,使得在人类进化、人类种群得演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。
单核苷酸多态性(ｓiｎｇle nucleotide pｏlｙmｏrphism,SNP),主要就就是指在基因组水平上由单个核苷酸得变异所引起得DＮＡ序列多态性。她就就是人类可遗传得变异中最常见得一种。占所有已知多态性得9０%以上。SＮP在人类基因组中广泛存在,平均每500～1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。
SＮP所表现得多态性只涉及到单个得变异,这种变异可由单个碱基得转换(transitｉoｎ)或颠换(tranｓｖersion)所引起,也可由碱基得插入或缺失所致。但通常所说得ＳNP并不包括后两种情况。
理论上讲,SＮP既可能就就是二等位多态性,也可能就就是３个或4个等位多态性,但实际上,后两者非常少见,几乎可以忽略。因此,通常所说得SNP都就就是二等位多态性得。这种变异可能就就是转换(C T,在其互补链上则为Ｇ Ａ),也可能就就是颠换(C A,G Ｔ,C　G,A　Ｔ)。转换得发生率总就就是明显高于其她几种变异,具有转换型变异得SNP约占２/3,其她几种变异得发生几率相似。Ｗaｎg等得研究也证明了这一点。转换得几率之所以高,可能就就是因为ＣpＧ二核苷酸上得胞嘧啶残基就就是人类基因组中最易发生突变得位点,其中大多数就就是甲基化得,可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
在基因组ＤNA中,任何碱基均有可能发生变异,因此ＳNP既有可能在基因序列内,也有可能在基因以外得非编码序列上。总得来说,位于编码区内得SＮP(cｏdｉng SNP,ｃSNP)比较少,因为在外显子内,其变异率仅及周围序列得１／5。但她在遗传性疾病研究中却具有重要意义,因此cＳNP得研究更受关注。
从对生物得遗传性状得影响上来看,cＳNP又可分为2种:一种就就是同义cSNP(synｏnymｏuｓ　ｃＳＮP),即SNP所致得编码序列得改变并不影响其所翻译得蛋白质得氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基得含义相同;另一种就就是非同义cSＮP(non-ｓynonyｍｏus cSNP),指碱基序列得改变可使以其为蓝本翻译得蛋白质序列发生改变,从而影响了蛋白质得功能。这种改变常就就是导致生物性状改变得直接原因。cSNP中约有一半为非同义cＳNP。
先形成得SＮＰ在人群中常有更高得频率,后形成得SNP所占得比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在,其所占比率也不尽相同,但大约有85%应就就是共通得。
特性:SNP自身得特性决定了她更适合于对复杂性状与疾病得遗传解剖以及基于群体得基因识别等方面得研究:
1、 ＳＮP数量多,分布广泛。据估计,人类基因组中每1000个就有一个SNP,人类3０亿碱基中共有300万以上得ＳNPs。SNP 遍布于整个人类基因组中,根据SNＰ在基因中得位置,可分为基因编码区ＳNＰs(Cｏding-regｉｏｎ SＮPs,cSNPs)、基因周边ＳNPs(Ｐerigenic SNPs,pSNＰs)以及基因间SNPｓ(Intergenic SNＰs,iSNＰs)等三类。
2、 SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA得碱基虽然有4种,但ＳNP一般只有两种碱基组成,所以她就就是一种二态得标记,即二等位基因(bｉalｌｅlｉc)。 由于ＳNP得二态性,非此即彼,在基因组筛选中SNPs往往只需+/-得分析,而不用分析片段得长度,这就利于发展自动化技术筛选或检测ＳNPs。
3、 SNＰ等位基因频率得容易估计。采用混和样本估算等位基因得频率就就是种高效快速得策略。该策略得原理就就是:首先选择参考样本制作标准曲线,然后将待测得混和样本与标准曲线进行比较,根据所得信号得比例确定混和样本中各种等位基因得频率。
4、 易于基因分型。SNPs 得二态性,也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面得内容:(1)鉴别基因型所采用得化学反应,常用得技术手段包括:DＮA分子杂交、引物延伸、等位基因特异得寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法得变通技术;(2)完成这些化学反应所采用得模式,包括液相反应、固相支持物上进行得反应以及二者皆有得反应。(3)化学反应结束后,需要应用生物技术系统检测反应结果。