第三章基因克隆的载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,基因工程原理,第一章 导 论,第二章 基因操作的工具酶,第三章 基因克隆的载体,第四章 基因克隆的策略,第五章 克隆基因的表达,第六章 基因工程的基本技术,第三章 基因克隆的载体,引 言（introduction）,第一节 质粒载体（plasimid vectors）,第二节 噬菌体载体（phage vectors）,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）,引 言,基因克隆的本质,是使目的基因在特定的条件下得到,扩增和表达,，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于,“载体”,及其,“寄主细胞”,来实现。,作为基因克隆的载体必须具备以下特性：,能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；,具有,1-2,个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；,具备多克隆位点（,MCS,），,而且可携带外源,DNA,片段的长度范围较宽。,自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和,DNA,的制备。,第一节 质粒载体,（plasimid vectors）,1、质粒的生物学特性,2、质粒载体相关知识介绍,1.质粒的生物学特性,（1）,质粒,是,一种广泛从在于细菌细胞中,染色体以,外,的能,自主的复制,的裸露的,环状双链DNA,分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。,1.质粒的生物学特性,（2）,质粒的大小,差异很大,，最小的只有1kb,只能,编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到,200kb。,（3）,质粒的生存,在寄主细胞中,“友好”,地,“借居”,，离开了寄主它本身无法复制，它可以,赋予 寄主一些非染色体控制的遗传性状,，以利于寄,主的生存。比如，,对抗菌素的抗性,，对重金属,的抗性等。,1.质粒的生物学特性,（4）,质粒的复制类型,一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的,拷贝数,。据拷贝数将质粒分为两种复制型：,“严紧型”质粒,（stigent plasmid）,拷贝数为1-3,；,“松弛型”,质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为10-60,。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。,（5）,质粒的不亲和性,两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。,1.质粒的生物学特性,（6）,质粒的存在形式,有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，,双螺旋共价闭合环（超螺旋）,开环双螺旋（一个裂口）,线状双螺旋（两个裂口）,质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA,最快、,l DNA,次之、,ocDNA,最慢。,SC,OC,L,1.质粒的生物学特性,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,非接合型质粒,不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员,某些非接合型质粒在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由,bom,和,mob,基因决定,天然质粒的局限性,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,第一节 质粒载体,（plasimid vectors）,1、质粒载体的生物学特性,2、质粒载体相关知识介绍,质粒载体：,作为基因工程载体，质粒至少应该具备,复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点,等部分。,多克隆位点,：,克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。,选择标记基因：,在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。,pBR322,4363,连接,加反应液,Tet,or,Amp,Tet,+,Amp,CK+,2.质粒载体相关知识介绍,（1）PBR322,pSP2124,质粒的,Amp,r,基因,pBR322,：,（,1,）元件来源,F.Bolivar,和,R.L.Rodriguez,人工构建载体。,复制起点,ori,pMB1,系列（来源于,ColE1,）的,高拷贝,型复制起点,Amp,r,基因,Tet,r,基因,pSC101,的,Tet,r,基因,。,（,2,）长度,4363bp,（,3,）选择标记,氨苄青霉素和四环素抗性。,（,4,）克隆位点,其中9个会导致,Tet,r,基因失活（如BamH I、Hind、Sal I）；,3个会导致,Amp,r,基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24,个克隆位点。,pBR322,的优点,双抗菌素抗性选择标记,插入失活，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞,在,Amp,或,Tet,中,都,死亡。,获得载体的寄主细胞,在,Amp,或,Tet,其中之一,中死亡。,外源基因,BamH I,Amp,中存活,但在,Tet,中死亡,外源基因,Pst I,Tet,中存活,但在,Amp,中死亡,氯霉素扩增之后，每个细胞可达,10003000copy,安全,失去了转移蛋白基因,mob,（,mobilization,）。不能通过接合转移。,高拷贝数,分子小，克隆能力大,载体越小越好。,10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。,保留了转移蛋白（,mob,）的,作用位点,。,pBR322,的缺点,能够被,ColK,质粒编码的,mob,蛋白识别，如果再有,F,质粒的参与，就有可能转移！,删除mob识别位点,（如质粒,pBR327,、,pAT153,等）。,pAT153,：,从,pBR322,上切去,HaeII,片断，既除去了,mob,识别位点，又增加质粒的拷贝数。,PBR322,的改进,pBR325,：,在,pBR322位点上接入一段来自噬菌体,PICm,的,HaeII,酶切片断（带有氯霉素抗性基因,cml,r,）。,cml,r,上也带一个,EcoRI,位点,。,使,EcoRI,也成为插入失活型位点。,改造,EcoR I,位点,（2）pUC,U,niversity of,C,alifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,2.质粒载体相关知识介绍,复制起点,pBR322,的,ori,但其上失去了克隆位点。,Amp,r,基因,（,1,）元件来源,lacZ,的启动子大肠杆菌,lacZ,基因,大肠杆菌,lacZ,的,-,肽链序列，,是,LacZ,的氨基端片断。,pBR322,的,Amp,r,基因,（,2,）长度,约,2.7kb,（,3,）克隆位点,10,个连续的单一限制酶切位点，位于,lacZ,基因的,5,端。,-互补,(,alpha,-complementation),大肠杆菌,-半乳糖苷酶,可以和其底物,X-Gal,相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的,-片段,和,-片段,分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶,-片段,的,Lac,Z,基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的,片段,。这样一来，含有功能性完整的,Lac,Z,基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的,-片段,就能和寄主编码的,片段,发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是,alpha,-complementation,.,所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物,X-Gal,和诱导物,IPTG,的平板上分辨出来。因为这类菌落中,释放出的,蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。,However,Cloning of DNA inserts into one of the unique sites in the polylinker can inactivates the,lacZ,gene and leads,to colourless colonies on X-Gal/IPTG plates,allowing,for ready,detection of colonies,carrying cloned DNA.,（3）pGEM-3Z,多拷贝,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记,lacZ,2.质粒载体相关知识介绍,（3）pGEM-3Z,装有两个噬菌体的强启动子,用于外源基因的,高效表达,T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli,BL21（DE3）等,表达型质粒载体,装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件，主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。,如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。,注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。,复制起始点,ORI,、,选择标记、,多克隆位点,MCS,2,）大肠杆菌操纵子元件,阻遏基因,I,操纵基因,O,启动基因,P,核糖体结合位点序列（,SD,）,转录终止信号区。,1,）普通载体元件,表达载体的,结构,（4）pET,pET vectors are,designed to,allow the,expression,of cloned genes to,proteins,.pET-5 has a region encoding an eleven amino acid stretch of protein before EcoRI and BamHI restriction sites.Cloning into these sites,results in,expression of the cloned insert as a fusion protein.,Use of,Nde,I enzyme in cutting vector and insert allows existed codon to be replaced by the initiation codon of the insert,resulting in,expression of the insert with no fusion.,2.质粒载体相关知识介绍,（4）pBluescript SK,pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage,f1.f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS,can be used to generate ssDNA.If a host cell carrying such a plasmid,superinfection with phage f1 leads to production of phage containing plasmid DNA.,2.质粒载体相关知识介绍,第三章 基因克隆的载体,引 言（introduction）,第一节 质粒载体（plasimid vectors）,第二节 噬菌体载体（phage vectors）,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）,第二节 噬菌体载体,（phage vectors）,1、,噬菌体的生物学特性,2、,噬菌体载体,3、M13噬菌体的生物学特性,4、M13噬菌体载体,1.,噬菌体的生物学特性,The Phage,consist of a linear chromosome enclosed in a protein coat(capsid,衣壳).When the phage infecting the host cells,it injects its DNA into the host bacterium.,1.,噬菌体的生物学特性,噬菌体的生长周期可分为,溶菌周期,和,溶源周期,两种类型。,前者指,噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在,溶源周期,中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。,只有溶菌生长周期的噬菌体被称为,烈性噬菌体,。只有溶源周期的噬菌体被称为,温和噬菌体,。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为,溶源性细菌,。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为,原噬菌体,。,1.,噬菌体的生物学特性,Lytic cycle(溶菌周期),of growth:,T,he injected DNA in host bacterium replicated many times,phage structural proteins are expressed and the new phage chromosomes are packaged into phage heads.New phages are then released by lysis(溶胞)of the host cell.,1.,噬菌体的生物学特性,Lysogenic cycle,(溶源周期),：,Under certain circumstances,however,the lambda DNA inserts itself into the E.coli chromosome and is a stable part of the chromosome.The Lambda DNA is replicated along Withthe,E.coli,chromosome.,If the host cell becomes damaged,such as,UV,treatment,the prophage DNA excises itself and,undergoes lytic growth.,l,噬菌体生物学特性：,溶原状态,l,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其,DNA,直接整合到宿主细胞的染色体,DNA,上并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为,溶原状态,。整合主要由,l,-DNA,上的,cI,和,int,两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变,l,-DNA,或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于,溶原状态,，或处于溶菌状态,DNA,重组技术一般需要,l,噬菌体进入溶菌状态,1.,噬菌体的生物学特性,DNA,为线状双链DNA分子,，长度为48502bp，在分子两端各有,12个碱基的单链互补粘性末端,。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为,cos位点,（cohesive end site）.,DNA至少包括61个基因，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。,l,噬菌体生物学特性：,生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制,基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l,-DNA,大肠杆菌的,l,噬菌体DNA,l,噬菌体生物学特性：,感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原,DNA的,75-105%,即,36-51 kb,D,A,第二节 噬菌体载体,（phage vectors）,1、,噬菌体的生物学特性,2、,噬菌体载体,3、M13噬菌体的生物学特性,4、M13噬菌体载体,l,-DNA载体的构建：,缩短长度,野生型,l,-DNA,包装的上限为,51kb,，本身长度为,48.5kb,，只有当插入的外源,DNA,片段不大于,2.5kb,时,，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型,l,-DNA,的长度，可以提高装载量。其实野生型,l,-DNA,上约有,40-50%,的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将,l,-DNA,分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,l,-DNA载体的构建：,缩短长度,插入型载体体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度,37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,l,-DNA载体的构建：,缩短长度,取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度,10 kb,（51 26）,载体长度,26 kb,插入片段,最大装载长度,25 kb,（36 26）,l,-DNA载体的构建：,删除重复的酶切位点,野生型的,l,-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1-2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一,些单一的酶切位点,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶,切位点,lDNA载体的构建：,加装选择标记,与质粒不同，野生型l,-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装,选择标记是,l,-DNA克隆载体构建的重要内容,l,-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,l,-DNA载体的构建：,加装选择标记,imm434,imm434,基因编码一种阻止,l,-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的,l,-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因灭,活，,l,-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,l,-DNA载体的构建：,加装选择标记,lacZ,lacZ,基因编码,b,-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到,lacZ,基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体,l,-DNA则产,生蓝色透明斑,l,-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon2、Charon6、,l,gt11,取代型载体,l,EMBL4、,l,gt,l,c、,l,NM762、Charon40,正选择型载体,l,EMBL1、,l,L47、,l,1059,l,-DNA重组分子的体外包装：,l,-DNA,重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞,用于体外包装的蛋白质可直接从感染了,l,噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少,E,组份，另一部分则缺少,D,组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组,l,-DNA,分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组,l,-DNA,污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,l,-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入,l,噬菌体或重组,l,噬菌体的悬浮液，,37,培养,1,小时,用新鲜培养基稀释，继续培养,4-12,小时。这时噬菌体颗粒,密度已达,10,13,-10,14,/L,，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放,l,-DNA,乙醇或异丙醇沉淀,l,-DNA,l,-DNA作为载体的优点：,l,-DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l,-DNA,载体的装载能力为,25 kb,，远远大于质粒的装载量,重组,l,-DNA分子,的筛选较为方便,重组,l,-DNA,分子的提取较为简便,l,-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,第二节 噬菌体载体,（phage vectors）,1、,噬菌体的生物学特性,2、,噬菌体载体,3、M13噬菌体的生物学特性,4、M13噬菌体载体,3.M13噬菌体的生物学特性,M13是线状的大肠杆菌噬菌体,，颗粒内含有6047个核苷酸的闭合环状单链DNA基因组，其,单链的基因组DNA,经改造后可作为单链的DNA载体。,因为M13单链DNA的,复制型,（RF，replicative form）是,呈双链环形,，此时的DNA可以象质粒DNA一样进行提取和体外操作。不论是双链还是单链的M13 DNA均能感染寄主细胞。而且,M13的颗粒不受包装的限制,，根据DNA的多寡其噬菌体的颗粒可大可小。,M13噬菌体将DNA正链注入寄主细胞后与单链DNA 结合蛋白结合，随后以小RNA链为引物合成负链而转变成RF。,正链和负链出现不对称性积累：,当RF积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成新了大量新的噬菌体颗粒。,新组装的噬菌体颗粒,并不会发生溶菌现象,，只是从寄主细胞中挤压出去。但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长，所以仍可产生,模糊的噬菌斑,。,在M13基因组中由一段,507bp的基因间隔区,，该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。,3.M13噬菌体的生物学特性,3.M13噬菌体的生物学特性,SS RF 1-1,RF RF 1-20,RF SS 20以上,The typical life cycle of M13,第二节 噬菌体载体,（phage vectors）,1、,噬菌体的生物学特性,2、,噬菌体载体,3、M13噬菌体的生物学特性,4、M13噬菌体载体,4.M13噬菌体载体,后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以,一般克隆的片段在1kb之内,，克隆,300-400bp的片段十分稳定。,载体中含有,Lac,Z基因及位于其中的多克隆位点，所以,能通过,互补在,X-Gal/IPTG平板上,识别重组体,。这类载体包括了,M13mp8、9 和 M13mp18、19等。,这类载体的,突出优点,在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其,最大的不足在于,插入大的DNA片段,M13 DNA载体的特点使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被,M13,噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混,浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊,斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有,1.5 kb,第三章 基因克隆的载体,引 言（introduction）,第一节 质粒载体（plasimid vectors）,第二节 噬菌体载体（phage vectors）,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的特点,柯斯质粒是一类人工构建的含有,DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。,柯斯质粒的大小为4-6kb，,由3部分组成：,A.多克隆位点区,B.含有cos位点的DNA区,C.复制起始位点和抗性标记区,pHC79,Ori,Marker,MCS,cos,DNA,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的特点,1、具有噬菌体的特性,柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。,2、具有质粒载体的特性,能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。,3、高容量的克隆能力,cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的应用,噬菌体的位点特异切割体系末端酶（terminase）体系要求两个cos位点间要保持38-54kb的距离。,下面的操作中缺点是：,cosmid自我重组、外源DNA片段串联,后重组。,Ori,Marker,MCS,cos,DNA,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的应用,1981年，Ish-Horowics和Burke设计了一种特殊的克隆方案，在所用的质粒上的,Bam,HI位点的两侧各有一个,Eco,RI位点包围着。这样在,Bam,HI位点克隆的DNA片段可以用,Eco,RI重新切割下来。,cos,Hin,dIII,Bam,HI,Sal,I,Sal,I,Hin,dIII,磷酸化酶,Sal,I,Bam,HI,Bam,HI,Hin,dIII,Bam,HI,Bam,HI,Sal,I,Hin,dIII,Sau,3A,磷酸 化酶,32-47 kb,第三章 基因克隆的载体,引 言（introduction）,第一节 质粒载体（plasimid vectors）,第二节 噬菌体载体（phage vectors）,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）,第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往,需要,克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,人造染色体载体,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在,50-300,kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC,载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Ap,r,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的,选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的,选择标记,YAC,载体的装载量为,350-400 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色体的使用：,pYAC4,CEN,EcoRI,URA,TEL,BamHI,TEL,ori,Ap,r,TRP,ARS,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,小 结,第一章 导 论,第二章 基因操作的工具酶,第三章 基因克隆的载体,第四章 基因克隆的策略,第五章 克隆基因的表达,第六章 基因工程的基本技术,第三章 基因克隆的载体,引 言（introduction）,第一节 质粒载体（plasimid vectors）,第二节 噬菌体载体（phage vectors）,第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）,