转基因动物研究概况.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,转基因动物前景广阔,提高动物的生长速度,改善畜产品的品质,珍稀药用蛋白的生产,（生物反应器或乳房生物反应器）,提供器官移植的供体,1,2,第一节 猪的基因工程育种,一、立项背景和研究目标,1、我国是传统的养猪大国，是世界上养猪最多的国家。,就全国而言,生猪存栏和出栏基本保持平稳发展,存栏和出栏呈现同步发展的趋势。2008年3月存栏4.1亿头，6月达到4.7亿头。能繁母猪比重超过12%。,3,不同品种猪-毛色,黑色,毛色为黑白花、除头、耳、背、,腰、臀为黑色外，其余均为,白色，黑白交界处有,4,5,cm,的黑皮白毛的灰色带,6,毛色为中间白，两头乌,为特征。又称“两头乌”。但也,有少数猪在背部有黑斑。,体毛黑色，,四肢末端为白色,7,全白,棕红色,8,被毛黑色，在肩和,前肢有一条白带围绕,被毛灰白，夹有黑斑，,杂有部分红色。,9,头大，额皮中部,隆起成块，俗称,“盖碗”,嘴筒长直,头型,10,头中等大，面微凹,头中等大，面直,11,猪的耳型描述,耳大下垂,耳大下垂,12,耳小而立,耳小向前平伸，,13,耳型,耳特大，下垂,耳小竖立,14,耳型,耳中等大，竖立,耳小向前平伸,15,体型,腹大下垂，背平,腹大拖地，背凹,16,体型,腹大下垂，不拖地,腹大下垂，不拖地,17,四肢,外展,X型,内展,18几个概念,活体重,胴体重,瘦肉率,眼肌,肉质性能,19,猪的宰前活重（kg),宰前12小时停食称重,屠宰日龄按当地习惯并注明,20,胴体重,胴体重：去除头、,蹄、尾、内脏、,包,括,板油、肾,的,左右两半胴体,总重。,21,瘦肉率,用手工剥离半胴体,分成瘦肉、脂肪、皮、骨四部分，分别称重，再相加，作为100%；（不计算分割过程中的损耗，不包,括,板油、肾）。分别计算瘦肉、脂肪、皮、骨所占的比例。,22,眼肌面积测量,最后肋骨处,背最长肌,横断面面积，,用硫酸纸描绘,眼肌面积,（2次）,23,眼肌面积测量2,用硫酸纸描绘眼肌面积（2次），用求积仪或方格计算纸求出眼肌面积（cm,2,）,或用下列公式：眼肌面积（cm,2,）=眼肌高度（cm）眼肌宽度（cm）0.7,眼肌高度,眼肌宽度,24,肉质性能,水份、,蛋白质、,肌内脂肪、,大理石纹,其它指标,25,3、猪是单胃动物，饲料的主要成份是粮食和块根、块茎。所以，猪的饲料和人的口粮是竞争性关系，不是互补的关系。养猪太多和猪的饲料转化效率太低，将会给种植业带来很大负担。,26,27,养猪主产区主要分布在粮食主产区应为比较合理的布局,当前我国生猪生产主要集中在四川盆地、黄淮流域玉米、小麦主产区、东北玉米主产区和长江中下游水稻主产区等四大地区。,从畜牧经济学角度出发，养猪业为耗粮型畜牧业，需要消耗大量的玉米等粮食作物，为降低成本，将粮食就地转化为畜产品，以提高农作物附加值，养猪主产区主要分布在粮食主产区应为比较合理的布局。,28,4、在制订“863”计划生物技术领域“七五”计划时，很自然的把利用转基因技术生产生长速度快、饲料报酬高的基因工程猪作为动物生物技术的首要课题。,5、课题的目标是通过10-15年的研究，利用在猪体内表达外源性猪的生长激素基因，生产出增重速度提高20，饲料消耗节约15，并能保持我国猪肉特有品质的基因工程猪品种。,29,二、目的基因的分离和表达载体的构建,在我国设立转基因猪的研究课题之前，已有美国、英国和澳大利亚等三个国家设立了同样的课题。美国利用现成的人生长激素基因作为目的基因，英国利用牛的生长激素基因，澳大利亚则构建了含有猪生长激素基因cDNA片段和染色体组基因片段的混合结构（mini-gene）。,30,此外一些与猪生产性能有关的基因,猪应激敏感基因(RYR1),Ch6,PSE,肉,应激,雌激素受体基因(ESR),Ch1,产仔数,促卵泡素亚基基因(FSH),Ch2，产仔数,RN基因,Ch15,酸肉,Napole产量,黑素皮质激素受体4(MC4R)基因,Ch1,ADG,BF,FI,心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因,Ch6,IMF,脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因,Ch4,IMF,猪肌肉生长抑制素(MYOG),Ch9,瘦肉率,31,兰尼定受体(,RYR1,)/氟烷基因(,Hal,)1843CT突变位点是造成猪应激综合症的主效,基因,位点。,Hha 酶切,对于Hal基因，淘汰nn、Nn个体，留用NN个体。,32,雌激素受体基因(,ESR,),ESR基因是影响猪产仔数的主效基因,Pvu酶切,发现BB 型比AA 型猪头胎总产仔数高3.37 头,33,克隆的猪生长激素基因全长约5.0kb，由4个外显子和3个内含子以及5端和3端调控序列组成。,目的基因的分离和表达载体的构建,以猪生长激素为例,猪生长激素Genomic基因结构序列被置于羊MT基因启动子控制之下，转基因在猪体内将受重金属离子诱导而表达。5MAR有屏蔽相邻基因影响的作用，而3端增加微卫星旨在提高整合率。,34,1、分离了2.5kb的一个猪生长激素基因片段，除去了它的5端和3端调控序列，只保留它的4个外显子和3个内含子。,2、将这个2.5kb的猪生长激素基因融合到长度为1.1kb羊MT1基因启动子的下游,构建成oMTpGH融合基因，是目的基因的基本表达结构。,3、为了基因的整合效率，还在融合基因的下游3增加了一段猪的微卫星DNA序列；,4、而在它的5端，又装上鸡溶菌酶基因的MAR序列，目的是为了克服或者更准确地说是减少基因表达时受邻近基因的干扰，便于从体外调控基因的表达。,为了能够人为地控制外源性猪生长激素基因的表达，采取了基因融合表达的战略，用羊的,重金属螯合蛋白 MT1基因,启动子来驱动猪的生长激素结构基因表达.,35,36,我国是首先使用猪的染色体组基因生产转基因猪的，实践证明，这种结构是有很多,优点,的。,第一、是没有异种蛋白质表达，生产出的猪仍然是纯天然的；,第二、基因表达适度和可控性强，表现在生产出生长速度比对照快70的转基因猪，而健康状况同正常猪没有差别；,第三、猪的死亡率低，生产转基因猪的效率比同类实验约高出一倍。,37,（一）母猪的超数排卵,直到目前为止，全世界生产转基因猪的主要方法仍然是直接向单细胞的胚胎注射纯化的DNA分子。在这种技术体系中，对母猪进行激素处理，使其生产大量受精卵，是生产转基因猪的先决条件。,要点,：1、摸索出超排时激素的最佳剂量,2、多获得处于单细胞阶段的原核期的胚胎,三、转基因技术体系的建立,38,39,应该在发情周期的第15-18天，按每公斤体重一次肌肉注射15个单位的用孕马血清促性腺激素,PMSG，促进卵巢上卵泡的发育。在注射PMSG第72小时，每头猪一次注射人绒毛膜促性腺激素,HCG500单位，促进卵子的排出，并在注射HCG后立刻进行自然交配或人工授精（表6-1）。,例：湖北白猪,40,什么时候冲卵可以得到较高比例的单细胞胚胎，要靠大量实验才能找到。,除了促进母猪多排卵以外，多获得处于单细胞阶段的原核期的胚胎也是至关重要的，因为只有胚胎在单细胞阶段时，才能用于基因转移。但是，猪是持续排卵的动物，卵子从卵巢上排出是一个连续过程，从排出第一个卵到排出最后一个卵，往往要持续数小时。,41,在注射PMSG之后的124-129小时之间冲卵，可以获得较高比例的单细胞胚胎(表6-2)。,在注射 HCG 后立刻进行自然交配或人工授精。大群猪的超排实验证明，激素处理可以使受精卵的获取量提高 2.1倍,。,42,自体移植：就是从一头猪的体内冲出单细胞胚胎之后，经体外注射DNA处理，再把胚胎移植回同一头猪的体内。,条件：,1、必须能够通过超排处理，一次获得较多胚胎，因为在冲卵过程中和显微注射时都会损失一部分胚胎，如果超排处理两头供体才能够移植一头受体，就不可能实行自体移植。,2、显微注射技术必须很熟练，能在很短时间内完成注射并且胚胎注射后的死亡率要很低，否则猪要长时间等在手术台上，对其健康和转基因后胚胎的成活都不利。,（二）自体移植技术在提高转基因猪生产效率中的作用,43,优点：,不但可以省去受体猪，而且猪的受孕率和产仔率均显著高于异体移植（表6-3）。,原因：,有可能是胚胎与母体发育同期化的程度比异体移植的受体好，也可能胚胎和母体间的相容性比异体好。,44,转基因猪的筛选一般是用PCR扩增特异DNA片段或用斑点杂交作为初筛手段，然后用southern杂交来进一步证实。,（三）外源GH基因定位和考贝数的测定,45,PCR,SOUTHERN,46,但是，对于培育转基因品种和目的基因稳定性研究来说，只知道基因是否已经整合是不够的，还应当知道基因在染色体上的整合位点和整合的考贝数。,47,1、选用经过斑点杂交和southern杂交证明是转基因阳性的猪6头，从静脉采血各5毫升，盛入放有肝素的生理盐水中摇匀并放在4中静置，使红血球沉降至管子的底部。,2、取上层的血浆层0.5毫升，接种于含有青霉素、链霉素和20胎牛血清的RPM1/1064培养基中，使血淋巴细胞增殖经过在37下培养60小时后，加入100g/ml,5-Brd11，继续培养12小时。,3、经过洗涤之后，将细胞重新悬浮在含有2.5gml胸腺嘧啶的新鲜培养基中，放置在37下再培养6小时，并于培养结束之前30分钟加入秋水仙素0.04g/ml。,方法：,48,4、细胞制备完毕，按常规方法制成外周血淋巴细胞的染色体标本。,5、用地高辛（Dig11dUTP）通过缺口翻译的方法标记探针。,6、将标记好的探针去杂交固定在玻片上的猪染色体，分子杂交之后，在PBS中洗涤玻片，并在除去多余的PBS之后，立即滴上胶体金标记反应液（10l胶体金标记的抗Dig抗体，加290l含1mg/ml BSA的PBS），室温下反应30分钟，用净水多次洗涤，除去氯离子。,7、在每张玻片上滴100l银增加剂，在室温中避光放置30分钟，洗去反应剂。,8、标记完毕的染色体标本经Giemsa和Hoechst33258染色显带，玻片自然干燥后就可以在显微镜下观察结果。,在显微镜下挑选中期相染色体清楚的细胞数十个到数百个，计算有银粒附着的频率，将银粒附着频率最高的染色体位点，定为,外源基因整合的位点,。,49,计算基因整合的考贝数：,方法：,1、提取组织中的DNA，再用同位素标记的探针去杂交，制成一系列浓度梯度样品。,2、利用FJ-2101型双道液体闪烁计数器计算样品放射性读数，按公式计算不同样品基因考贝数，取其平均数作为外源基因整合的大致考贝数。,一般文献中计算基因整合的考贝数，都是比较样品 DNA 与质粒 DNA 标记物的强度，大致估计出外源基因的考贝数。我们在研究中采用了放射性标记物计数的方法，也可以估计基因的考贝数。,50,四、转基因猪的生产,此表列出了课题生产转基因猪的情况，同时在表中也列出了美国、英国和澳大利亚进行同类实验的数据，以资比较。,51,五、外源基因的遗传稳定性,外源基因一旦整合到猪的染色体上，其遗传是稳定的。,例：一个家系的4代转基因猪中外源GH基因的追踪试验，可以肯定地证明从G0代传到G3代时，基因仍稳定地整合在同一条染色体上(表6-7)。这个家系的猪都在第13号染色体上含有外源的生长激素基因。,52,53,六、转基因猪的生产性能,1、经过对三个世代的转基因猪进行严格的饲养实验，证明表达外源性生长激素基因的确可以提高猪的生长速度，饲料转化效率和瘦肉率。,2、在饲料中蛋白质含量达到18 的条件下，转基因猪的生长速度提高1015，饲料报酬和瘦肉率提高10 左右。与美国Pursel等和澳大利亚Vize等得到的结果很相似（Pursel et al 1989;Vize et al，1988年）。,54,3、美国 Pursel 等人得到的转基因猪出现了严重的负作用，表现出各种病理状况，而澳大利亚和我国生产的转基因猪似乎很健康。美国 Pursel 等人生产转基因猪时使用了人的生长激素基因，而澳大利亚和我国使用的是猪的生长激素基因。,55,七、转基因猪研究的发展前景（表6-8）,转基因猪分类：,第一类：猪一切表现都正常，生长速度提高了1015%，饲料转化效率提高了10%；,第二类：猪表现出良好的生长特性，生长速度可以提高50%以上，生产每公斤体重可以节约饲料三分之一，但性状不能遗传；,第三类：猪是一些因外源基因的插入而产生各种畸变的个体。,主要问题：转基因猪外源基因传了七代仍未生产出纯合的转基因家系，给转基因猪的发展前景蒙上一层阴影。,56,表,6.8,转基因猪的生长速度和饲料报酬,57,突破方面：,1、用猪作为一种生物反应器已有很成功的例子，美国已在猪的乳腺中表达了人的,C蛋白基因,，表达水平达到1克升（Velander et al，1992年）。也许还可以在猪的血液中表达某些血液蛋白，使猪的血液变成养猪业中的一种副产品，这适用于生产那些用量大和单位价格不太高的产品，如人的血清白蛋白和血红蛋白等。,2、猪的器官作为人的器官移植供应来源.,3、就改善猪的经济性状而言，还有其它一些侯选基因和新的技术思路。如组织特异性表达外源性生长因子或通过基因定位整合技术提高内源性生长因子的表达量，就是很好的探索途径。,58,第二节 动物乳腺生物反应器,一、立项背景和项目的总体目标,背景：1987年，美国NIH的科学家与Integrated Gerutics公司合作，首次展示了用动物乳腺生产医用蛋白质的可能性（Gordon et al，1987年）。在此后的5年时间内，若干有医学价值的蛋白质基因在牛和羊等大动物的乳腺中获得高效表达(simons et al，1988；wall，et al 1991年；ebert et al，1991年；krimpenfort et al，1991)。,59,总体目标：建立有效的技术体系，在目的基因、表达载体、转基因技术、纯化工艺和基地建设等主要技术环节上取得实破，使我国可以有效地在动物乳腺生产高价值的蛋白质，为产业化打下坚实的基础。,一、立项背景和项目的总体目标,60,目的基因是动物乳腺生物反应器研究的关键问题。,动物乳腺表达外源基因优点,：表达量高、产品生物活性好和原料成本低。,对象,：用量大和需要翻译后加工的蛋白质产品。,原因,：发挥动物乳腺的优势，同时也是为了不与现有的其它基因表达体系产生竞争。,二、目的基因研究,61,这些产品大都是血液蛋白和具有特殊营养价值的蛋白质，产品的用量都比较大，难以用其它系统生产。,62,1997后，更多的公司加入动物乳腺生物反应器技术的开发，使用的目的基因也更加多样化。,分类：抗体，细胞因子、疫苗、组织修复材料、受体、激素、食用蛋白和滋补药等8大类产品（all,1999）。,我国开始进行动物乳腺生物应器技术的大规模研究，比国外晚大约10年时间。在选择目的基因时，主要考虑问题首先是产品有无市场前景，其次考虑有无自己的知识产权（表6-10）。,63,说明：在“九五”的主要目标是建立技术体系，对于目的基因没有进行严格审查和限制。,64,三、乳腺组织特异性表达载体研究,动物乳腺组织特异性高效表达载体,是研制动物乳腺生物反应器的重要生物元件，外源基因在动物乳腺中的高效表达，必须依赖好的表达载体表（表6-11）。,65,动物乳腺组织特异性表达载体作为一种重要生物元件，受知识产权法规的保护，国外公司已纷纷申请专利。,英国PPL公司申请了BLG的专利，美国Genyme公司申请了casein的专利，而荷兰的Pharming公司申请了si-casein的专利。,但是这些公司都没有在中国申请专利，我们仍然可以在国内自由地使用这些载体。我们已完成了BLG和si-casein表达载体的构建，并申请了专利保护。,66,动物乳腺生物反应器的操作过程,获取目的基因（例如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达）。,67,转基因技术是研究动物乳腺生物反应器的瓶颈，极大地限制了这项重要技术的发展。,目前：生产转基因动物的主要技术仍然是向原核期胚胎直接注射纯化的DNA分子。,优点,：重复性非常好,缺点,：不能保证经过注射DNA的胚胎都发育成转基因动物，即使已经准确无误地将几百个考贝的DNA分子注入到每一个胚胎的原核中，发育成功的幼畜中仍然只有一小部分是整合了外源DNA的转基因动物。,成功率：绵羊、山羊和猪1/100;牛1/500。,四、转基因技术,68,技术路线：,第一种技术路线,是，对供体母畜实行激素超排处理，然后进行手术冲取原核期胚胎，在体外进行DNA显微注射后，再把它们移植到同期发情的受体母畜体内。,国际上通用的方法。,优点：注射后的胚胎直接移植到母体内发育，因而每百枚移植的胚胎可以得到较多的仔畜（表6-12）。,69,70,第二种技术路线,是，体外受精技术加显微注射。这种技术不需要供体母畜，直接从屠宰场收集新鲜卵巢，吸取未成熟卵母细胞，体外培养成熟和体外受精，发育成的原核胚显微注射DNA后继续培养，发育到囊胚时再移植到受体动物体内。,基于试管动物技术和显微注射相结合的一种工艺。,优点：可以利用屠宰场大量的废弃卵巢，把实验规模做得很大。,缺点：需要有很好的体外培养条件，有时还需要具备有效的胚胎冷冻技术。,Z2401课题利用新西兰丰富的卵巢资源，在国外租用实验条件进行大规模转基因试验，注射了两万多枚胚胎，冷冻保存了几千枚注射DNA后发育而成的囊胚（表6-13）。,71,72,第三种技术路线,是，通过体细胞克隆转基因（表6-14）。先在培养的体细胞中完成基因转移，然后用转基因体细胞作核供体，用体外培养的去核卵母细胞作细胞质受体，经过核移植生产转基因胚胎。,优点：充分运用了在体细胞中转移基因和筛选整合外源基因的细胞系的高效率，并通过克隆过程和将体细胞直接变成转基因动物。,73,2002年9月28日至10月7日，青岛森淼实业有限公司与中国科学院遗传与发育生物学研究所成功地克隆出只带有医用蛋白的转基因体细胞克隆奶山羊。,74,表6-14 体细胞克隆生产转基因动物,重构胚胎数,发育胚胎数,囊胚数,囊胚率,绵羊,337,318,64,19%,奶牛,885,745,278,31.4%,首先，它克服了必须在胚胎的原核期注射DNA的限制，改为向培养的体细胞转移DNA，把基因转移的工作由现场转移到实验室，由季节性变成常年性，使工作更加从容。,其次，由于生产出来的仔代全部都是转基因个体，而且可以预选性别，可使受体动物的数目大大减少，节约大量运作成本。,第三，可以按照市场需要，一次性建立生产畜群，节约产品投产时间。,体细胞克隆的方法将取代现有的方法，成为生产转基因动物的主要技术。,优越性：,75,第三节 器官移植用转基因动物,一、项目的主要目标,器官移植是挽救人的性命的重要医学手段，是一种没有其它方法可以代替的医疗技术。,在所有家养动物中，,猪,被认为是最适宜向人类供应器官的动物，因为它的器官的尺寸和许多生理特点更接近于人类。,但是，要把猪的器官变成可供人类使用的器官，需要闯过三个关口。首先用基因工程技术克服“超急性排斥”，然后再设法克服“延缓性排斥”。,76,引起人体免疫系统对猪的器官产生“超急性排斥”反应的，主要是猪器官细胞表面的G抗原。,G抗原的形成，是半乳糖苷转移酶的作用，致使猪器官细胞表面形成了GAL13GAL的表位，能被人体免疫系统识别为异物，从而加以排斥。,最根本和最重要的是去掉合成G抗原的半乳糖苷转移酶基因，其次是抑制补体系统和淋巴细胞。,去除排斥反应,77,二、研究工作的主要进展,1、目的基因的克隆,一半乳糖苷转移酶基因（GT基因）：,用反义RNA的方法生产转基因猪，以便检测在GT基因表达量减少的情况下，猪的器官在移植到具有H抗原的灵长类动物中时，受排斥程度是否会降低。,FASL基因：,ASL基因是调节淋巴细胞凋亡的重要因素，T细胞识别靶细胞之后，首先表达FAS基因，使淋巴细胞增殖，产生大量效应细胞，对靶细胞进行攻击，达到杀死和排斥异体细胞的目的。在靶细胞消失之后，淋巴细胞表达FASL基因，在细胞表面形成配体。配体FASL和另一个细胞表面的受体FAS相互作用，激活细胞凋亡的信号通路，导致淋巴细胞自行凋亡。如果靶组织的细胞表面也表达FASL配体，遭遇淋巴细胞攻击时，不但不会被杀死，反而会造成淋巴细胞凋亡，从而造成机体的免疫耐受，便于接纳异种器官移植。,DAF基因和MCP基因：,阻止补体复合物的形成，大量表达DAF和MCP基因产物，可以有效抑制人体补体系统对猪器官的毒杀。,78,2、转基因小鼠的生产及目的基因功能研究,郭礼和等人用他们克隆的GT基因构建了反义RNA表达结构，生产出转基因小鼠，并通过杂交的方法得到了基因纯合的小鼠品系。经过对小鼠的各种组织进行RTPCR和免疫荧光组织化学检测，证明各种组织G抗原的表达量都有不同程度的下降。,郭礼和等人还用FASL基因生产出转基因小鼠这种小鼠的脑组织被移植到患有帕金森氏症的大鼠脑组织中后，小鼠的组织可以耐受大鼠免疫系统的攻击，大鼠的病情明显好转。,79,2、转基因小鼠的生产及目的基因功能研究,孙方臻等人用DAF基因生产出转基因小鼠，利用人血浆体外灌注系统对部分小鼠进行抗超急性排斥反应（HAR）的检验。实验结果证明，对照小鼠的心脏在灌注人的血浆之后，心脏和心电活动的持续时间平均为110分钟，而不同转基因小鼠个体心电和心跳的持续时间，可以达到130260分钟。,80,3、转基因猪的生产,湖北省农业科学院魏庆信等人利用GT反义基因和DAF基因进行了转基因猪的生产（表6-15）。,对初筛出来的阳性hDAF基因猪进行染色体原位杂交表明，有6头原代转基因猪在染色体的一个位点上整合了外源基因，同其它种类的转基因猪一样，外源基因的整合位点完全是随机的。,81,例：某一头猪在心脏中DAF基因没有表达或者表达水平很低，假若用这头猪的心脏去进行异体移植实验并导致失败，也绝对不能够否定这条技术路线。在此后的检测表达情况的实验中，确实证明上述6头原代转基因猪中，只有4头在动脉的肌肉层中测到了表达产物，其余2头同非转基因猪一样，未能测到DAF基因表达（表6-16）。,82,4、转HDAF基因猪的生物学效应,为了测试hDAF基因在转基因猪体细胞中表达产物的生物学效应，对总数为14头原代和继代转基因猪的淋巴细胞进行了人血清毒杀试验。,方法：从阳性转基因猪和未转基因的对照猪耳静脉采血，分离淋巴细胞，然后用新鲜的混合人血清毒杀，4小时后于倒置显微镜下观察淋巴细胞的存活情况。,结果：有一半转基因猪的淋巴细胞可以不同程度地抵御人血清的毒杀作用，其余7头转基因猪和对照猪的淋巴细胞则完全不能（表6-17）。,83,84,陈实等人选择G1代转hDAF基因的猪5头和非转基因猪3头，取其心脏进行了弥猴移植实验。,方法：采取异位心脏移植模型，将猪的心脏置于弥猴腹腔内，使其主动脉和肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉行端侧吻合。,结果：非转基因猪的心脏在手术未完成之前就发生超急性排斥反应，而5头转基因猪的心脏均克服了超急性排斥，最长的一例心脏存活90小时以上（表6-18）。,85,移植实验的结果表明：通过表达hDAF基因可以有效地克服异种移植中发生的超急性免疫排斥反应。,克服超急性免疫排斥反应方法：,1、通过基因定位整合删除G抗原基因，或者用H抗原替代G抗原；,2、通过表达FASL抑制T细胞的功能；,3、通过表达DAF和MCP来抑制补体系统对异种器官的排斥功能。,移植实验：,86,但是：猪的器官可以在实验猴身上存活很长时间，距离在人体上实际运用还会有很长时间，还有大量工作需要去做。,为什么：,首先，是要生产出稳定的供体品种，品种中每一个体都可以提供质量一致的可供移植的器官；,其次，要使这些动物不带有病毒，以免经过人体移植过程产生出像HIV那样的致命病毒；,第三，需要经过长期的临床实验，最后才能决定是否可以用在人体上。,87,