第四章动物组织细胞培养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,目录,4.1,动物细胞体外培养环境,4.2,动物细胞体外培养方法,4.3,动物细胞体外培养的生物学特性,4.4,培养细胞常规检查和特性鉴定,4.5,细胞同步化,4.6,细胞冷冻与复苏,4.7,器官培养,1,防止污染,、,无菌操作,是动物组织培养成功的关键！,2,1）,培养前准备：,制定实验计划和操作程序。,2）,超净台,要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。,3）,个人,进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。,4）,实验中,需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。,5）,分别使用,不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用,6）,不要用手,触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。,7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。,3,基本概念,6,4.1动物细胞体外培养环境,4.1.1 温度,4.1.2 pH,4.1.3 渗透压,4.1.4 气相,4.1.5 生长基质,7,4.1.1 温度,无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一是恒定的适宜的温度环境。,人和大多数哺乳动物培养细胞的,最适温度,在37左右。培养细胞对,低温,的耐受力比对,高温,强。,8,4.1.1 温度,细胞培养在3940中1 h，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在4142的温度条件下培养1 h，细胞则会受到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。当温度达43以上时，细胞大多死亡。,温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于0时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。,9,4.1.2 pH,细胞内、外pH调节是哺乳动物细胞和机体生存的基本条件。pH不仅对维持离子平衡，而且对保持细胞的最佳酶功能状态和激素及生长因子对细胞表面受体的亲和力都很重要。,10,4.1.2 pH,大多数培养液设计的pH为,7.0,7.,4,，,最适宜是,7.2,，,不同的细胞类型可能有一个小的最适pH变化范围，细胞能够耐受pH在这个范围内的偏离，大多数细胞能耐受的培养液pH范围为,6.,8,7.,6,，超出这一范围会致死细胞。,11,4.1.3 渗透压,渗透压；,260320,mOsm/kg适用于大多数细胞,。,12,4.1.4 气相,O,2,(oxygen)参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量；CO,2,(carbondioxide)主要与维持培养液的酸碱度有直接关系。,大多数体外培养的气相环境为含,5,的CO,2,和,95,空气的混合气体，其中氧浓度为2121.3 kPa(160mmHg)必要时，可通人N,2,以稀释O,2,，调节培养箱内O,2,的浓度。,13,4.1.5 生长基质,在体内条件下，大部分细胞贴附于结缔组织、基膜或矿物基质(如骨组织)。仅有血液、淋巴和其他液体内的细胞能够在悬浮状态下生长。,多聚赖氨酸 纤维连接蛋白 层粘连蛋白,胶原 亲玻粘连蛋白 韧粘素 人工膜 饲养层,14,4.2动物细胞体外培养方法,4.2.1原代培养与传代培养,4.2.2动物细胞培养的方法,4.2.3动物细胞大规模培养技术,15,4.2.1原代培养与传代培养,大多数体外培养的动物细胞都需要贴附于适当的基质上才能生长，细胞的这种特性叫做,贴壁依赖性,(anchorage-dependent)依据细胞的生长是否需要贴壁，动物细胞体外培养又可分为两类：,贴壁培养,(adherent culture)和,悬浮培养,(suspension culture)。,16,4.2.1原代培养与传代培养,在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为,原代培养,或称,初代培养,(primary culture)和,传代培养,(subculture)，传代培养又称,继代培养,(secondary culture)。,17,4.2.1原代培养与传代培养,原代培养,是从机体取得材料开始，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，直到第一次传代前的这一培养过程。,原代培养的培养物的结构形式分为两种，一种是利用小块组织或称为,组织块,(tissue block)进行培养，另一种是将机体组织分散后制成,单细胞,进行培养,（酶消化法）,。,18,4.2.1.1原代培养,组织块原代培养,19,4.2.1.1原代培养,组织块原代培养,20,4.2.1.1原代培养,组织块原代培养,21,4.2.1.1原代培养,离散细胞,原代培养,在组织消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、裂解酶及链霉蛋白酶的粗制品等。这些酶既可单独使用，又可多种联合使用。因为粗制品常混杂有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有效，而精制品更具有特异性，并且毒性小。胰蛋白酶和链霉蛋白酶解离效果较强，但会造成细胞损伤；相反，胶原酶和裂解酶解离效果较弱，但对细胞损伤较小。透明质酸酶可以与胶原酶合用以消化细胞间基质。脱氧核糖核酸酶可用来分解由破碎细胞释放的DNA，因为DNA可减弱蛋白水解作用，并促进蛋白再聚合。,22,取材,(,取鼠胚,),1）用引颈法杀死动物,2）浸入75酒精中5分钟消毒,3）开腹取材,23,24,25,单细胞分离,胰蛋白酶法,适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等,钙离子、镁离子、血清等都对其有抑制作用。,26,细胞计数,接种培养,27,4.2.1.1原代培养,原代培养注意事项,虽然各种细胞培养需要满足不同的条件，但有几种条件是大多数原代培养共同需要的：在取材时需去除脂肪和坏死的组织；为减小对组织的损伤，需用锋利的器具；适度离心以去除用于解离的酶；由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度；营养丰富的培养基如Hams Fl2比单一的培养基(如，EaglesMEM)更可取；胚胎组织在原代培养中更易分离，细胞较易存活，增殖速度较快，故比成年组织更可取。,28,4.2.1.2传代培养,随着原代培养物培养时间的延长、细胞分裂增殖的进行，培养物体积或密度会越来越大，一方面可能会长满培养空间，另一方面分裂增殖的细胞会互相接触而发生,接触性抑制,，生长速度逐渐减慢甚至停止。,29,接触抑制,定义：,细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。,30,4.2.1.2传代培养,将细胞培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为,传代培养,(passage culture)。,原则上，传代是以原代培养物帖壁生长长满培养器皿的生长面或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，但传代的具体时间并没有固定的时间，操作者可以根据具体情况安排传代时间。但是，提前或推后传代都不可取，尤其是后者。,31,4.2.1.2传代培养,贴壁培养,(1)原代培养物或传代细胞形成细胞单层后，倒掉旧培养液。,(2)用PBS或PE(含有0.02%EDTA的PBS)洗细胞单层12次，以洗去死细胞和残存的培养液。,(3)消化：0.25%胰蛋白酶溶液和0.02%的EDTA 37条件下消化515 min,(4)消化完成时，吸去或者倾出消化液，立即加入蛋白酶抑制剂或者有血清培养液。,32,4.2.1.2传代培养,贴壁培养,(5)离心(1000 rmin，5 min)，除去上清含酶溶液。,(6)用培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。,(7)接种在新的培养瓶皿内。一般接种在两个或者多个培养瓶皿内。有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。,8)分别补加培养液后，送入培养箱中继续培养。,33,细胞贴壁过程,34,细胞计数,原理,细胞计数结果以细胞数,/毫升表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做,细胞活力,，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰(trypan blue)染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。,35,细胞计数,仪器、用品与试剂,1、仪器与用品：,普通显微镜、血球计数板、试管、吸管,2、试剂：,0.4台盼兰(台盼兰0.4克加双蒸水至100ml),3、材料：,细胞悬液(细胞悬液的制备：用毛吸管吸5滴细胞悬液到一小试管中，加入1滴台盼蓝染液（0.4），混匀，静置23min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。),36,细胞计数,操作步骤,1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。,2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板,之间。,3、静置3分钟。,4、镜下观察,，,然后按下式计算：,（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)稀释倍数,10,4,/ml,37,细胞计数要点：,1.要求悬液中细胞数目不低于10,4,个/ml，,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于,少量培养液中；,2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否,则影响计数准确性。,38,细胞计数,细胞计数要点：,3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；,4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。,5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。,39,细胞计数,初学者易犯的错误：,1.计数前未将待测悬液吹打均匀。,2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。,3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽,中。,40,4.2.1.2传代培养,悬浮培养,适用细胞：血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)以及某些转化细胞。,方法：不用消化液 停止摇动 吸出部分细胞,补加培养液,41,4.2.2动物细胞培养的基本方法,体外培养这门技术，说到底就是将活的组织、细胞、器官或者微小个体放在一个不会被其他微生物污染的培养器皿内而维持其生存、生长的技术。既然如此，由于拟培养的对象不同、拟放置的培养器皿不同以及维持生存与生长的方法不同，体外培养就可分为许多不同的方法或技术。,42,4.2.2动物细胞培养的基本方法,悬滴培养法,培养瓶培养法,旋转管培养法,灌注小室培养法,培养板培养法,43,单盖玻片悬滴培养法,将培养液滴于盖玻片上并铺展开,将待培养的组织块铺展于培养液中央,将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封,贴壁24小时内，细胞就能从组织块四周游走,适用于组织量少的,原代培养,44,单玻片的再培养,1）用消毒剃须刀刮去盖玻片四周的石蜡,2）用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿内。,3）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。,4）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。,45,双盖玻片悬滴培养法,方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，将两张盖玻片贴牢在一起。,培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。,优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。,46,培养瓶培养法,器材：,培养瓶,材料：,组织块或单层细胞,方法：,单层细胞用消化培养法，将组织消化成为细胞悬液后培养,组织块以间距0.5cm均匀摆置在瓶壁上，翻转瓶，注入适宜培养液，37恒温24小时，待贴附后，再翻转平放，静置培养。,47,培养瓶（传代）培养,48,旋转管培养法,器材：旋转管，旋转瓶,由于旋转作用组织块和细胞交替地与培养基和空气直接接触。,49,灌注小室培养法,基于悬滴培养建立的方法，可用来连续观察的细胞的动态变化,50,培养板培养法,用于对培养物进行规范的、定量的组间比较。,51,4.3动物细胞体外培养的生物学特性,由于体内和体外环境不同，培养细胞的生物特性有所不同。在培养细胞期间，要对细胞进行常规性检测。,细胞形态、细胞生长状况、营养液、微生物污染等方面进行检查。,52,4.3动物细胞体外培养的生物学特性,在细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可以变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成成纤维细胞等。可利用活细胞相差显微镜观察并摄影其一般形态结构、超微结构和细胞骨架等。,53,4.3动物细胞体外培养的生物学特性,体外培养的细胞，按照其生长方式大体可分为,贴壁依赖性(黏附型),和,非贴壁依赖性(悬浮型),两大类。,贴壁依赖性细胞分四类：,成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型和多形细胞型,54,4.3.1,细胞体外生长形态,成纤维细胞型,细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙，有时也见平行排列，成群细胞呈现放射状、旋涡状等走行形式。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现这种形式，例如成纤维细胞以及其他主要的结缔组织细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、胶质细胞、胚胎间充质细胞等多呈此型在体外培养动物细胞时，经常遇到培养物中出现成纤维细胞型的细胞，因确切类型不明，一般称之为成纤维细胞样细胞(fibroblast-like cell)。,55,4.3.1,细胞体外生长形态,成纤维细胞型,56,4.3.1,贴壁依赖性细胞,57,58,59,4.3.1,贴壁依赖性细胞,上皮细胞型,细胞呈扁平，形态较为规整，细胞大致为多边形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为相互拥挤而呈现“铺路石样”上皮型细胞并不等于动物体内上皮组织的细胞。起源于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时都有可能呈现上皮型。例如皮肤表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞、胰脏细胞以及上皮源性的鳞癌细胞等。,60,4.3.1,贴壁依赖性细胞,上皮细胞型,61,4.3.1,贴壁依赖性细胞,62,4.3.1,贴壁依赖性细胞,游走细胞型,细胞形态不稳定，相互散在生长，一般不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒，常具有胞质突起(伪足)。这类细胞在培养器皿壁上生长的位置不固定，常活跃地游走或做变形运动，速度快且方向不规则，一般不连成片。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维型细胞。如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffer cell)以及某些肿瘤细胞等。,63,4.3.1,贴壁依赖性细胞,64,4.3.1,贴壁依赖性细胞,多形细胞型,多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，但它不像成纤维细胞型的细胞那样，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分组成，胞体略呈多角形，但无成纤维细胞型那样不规则；胞突为细长形，似丝状伪足。体外培养的神经元细胞及神经胶质细胞属于此类，细胞由神经元本体和树枝状的树突构成。,65,66,4.3.1非,贴壁依赖性细胞,主要形态学特点是胞体始终为,球形,。,优点,：能以悬浮状态生长的细胞，密度一般都可以较大，故培养的效率高。以这种方式培养细胞时，转换培养液、补加培养液以及收获细胞都比较容易。不足：,不方便观察。,67,4.3.2培养,细胞的生长曲线,生长曲线,(growth curve)反映的是培养细胞从接种到传代之前的生长增殖情况,根据接种和每一次传代培养的细胞生长的变化过程，一般把每一代细胞的生长过程分为,潜伏期,(latent phase)、,指数生长期,(logarithmic growth phase)、,平台期,(plateau phase)和,衰退期,(senescence phase)四个时期,68,4.3.2培养,细胞的生长曲线,1潜伏期,2指数生长期,3稳定期(平台期),4衰退(亡)期,69,4.3.2培养,细胞的生长曲线,潜伏期,特点：,细胞有生长活动而无细胞分裂。,时间：长短与细胞种类、接种的细胞密度、,培养条件等因素有关。原代培养细胞,的潜伏期长，为2496 h；细胞系的,潜伏期短，为624 h。,70,4.3.2培养,细胞的生长曲线,指数生长期,指数生长期,是细胞增生最活跃、细胞活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数目呈指数增长，进行实验研究一般选择此期细胞。,持续时间,：35 d,71,4.3.2培养,细胞的生长曲线,平台期(plateau phase)也称停滞期,(stagnatephase)，意即细胞不再分裂增殖，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞。,特点：细胞仍有代谢活动，但生长活动极为,缓慢。,提示：传代。,72,传代培养细胞增殖规律,a.,新传代的单层细胞，传代,24 h,；,b.,对数中期细胞，,传代,后,3 d,，需要更换培养液；,c.,早平台期细胞，传代后,7 d,，需要再次传代,。,a,b,c,73,4.3.2培养,细胞的生长曲线,衰退期,由于没有及时传代，培养液中营养物质耗尽，代谢废物累积，pH值降低，使细胞发生中毒性改变，甚至脱落死亡。也就是进入了衰退期。,衰退期,不同于细胞的停滞期。处于停滞期的细胞可通过传代进行挽救，而处于衰退期的细胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向发展。,74,4.4,培养细胞常规检查和特性鉴定,污染：,与培养无关的杂质混入培养系统称为污染(contamination)。包括各类微生物的污染、各种培养物间的交叉污染和化学物质的污染。后两种污染比较容易预防，而微生物污染的预防及处理就比较困难，它能直接影响后续研究工作。,75,4.4.1,培养细胞常规检查,培养液pH值,偏酸黄；中性樱桃红色；偏碱,深,红色,提示,变黄的情形有两种：一种是CO,2,；另一种情形是由于污染的细菌或霉菌的大量生长，从而使培养液变黄变混浊。,76,4.4.1,培养细胞常规检查,细胞健康状况,良好,：透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡，胞膜清晰，培养上清清澈透明,不良,：胞质中常出现空泡、脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点。,77,4.4.1,培养细胞常规检查,微生物污染及其排除,微生物污染途径,a.,空气：,空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。,b.,培养液,：,配制过程发生污染。,c.,操作：,无菌观念不强。,d.,血清：,质量不好、检查不严。,e.,组织样本：,避免用碘消毒,、内源性病毒,。,78,4.4.1,培养细胞常规检查,微生物污染及其排除,细菌污染,观察,：污染较轻培养液清亮；污染严,重时培养液变混浊,检测,：去培养液肉,汤,培养或涂板,排除,：抗生素(常用量的5-10倍)；丢弃,79,4.4.1,培养细胞常规检查,微生物污染及其排除,真菌污染,(酵母菌和霉菌),酵母菌污染,类似细菌。观察到圆形或卵圆形,的酵母菌且可闻到像酒或酸的发,酵样异味。,霉菌,显微镜观测,80,4.4.1,培养细胞常规检查,微生物污染及其排除,支原体污染,特点,：培养液不混浊，多数细胞无明显变化，生长缓慢，严重时细胞脱壁死亡。,检测：,光学显微镜；地衣红染色；荧光法。,排除,：热处理,（41，5-10h。）；巨噬细胞吞,噬法；动物体内接种法。,81,4.4.1,培养细胞常规检查,微生物污染及其排除,病毒污染,要判断培养细胞是否被病毒污染，还可以应用电子显微镜观察或用商品化的试剂进行免疫学染色。,82,4.4.1,培养细胞常规检查,微生物污染及其排除,83,4.4.1,培养细胞常规检查,细胞交叉污染,化学物质污染,84,4.4.2细胞系鉴定的方法,细胞系,(Cell Line)：原代培养后经首次传代成功即成细胞系。,细胞株,(Cell Strain)：把一个单细胞从一个群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍成为一个新的细胞群体。,85,4.4.2细胞系鉴定的方法,细胞系的演化,原代培养阶段有限细胞系阶段连续细胞系阶段,细胞系的转化,86,4.4.2细胞系鉴定的方法,形态学分析,形态学分析是一种最简单最直接的细胞系鉴定方法,要求：相同的培养液、相同的细胞密度、相 同的生长阶段,87,4.4.2细胞系鉴定的方法,细胞生长情况的分析,生长曲线,：可测知细胞倍增时间。,分裂指数,：用以表示细胞增殖旺盛程度。即每100个细胞中处于分裂相的细胞所占的比例。,分裂指数=分裂细胞数/总细胞数100%,集落形成率或克隆形成率,：反映细胞独立生存能力,88,4.4.2细胞系鉴定的方法,染色体分析,不同生物的体细胞染色体各有其一定的数目、形状和结构，而且这些特征在其正常细胞周期和生命周期过程中保持稳定。,89,4.4.2细胞系鉴定的方法,同工酶分析,原因：同工酶是指同一种属中由不同基因位点或同一位点的复等位基因编码的多肽链所组成的单体、同聚体或杂聚体。同工酶具有种属特异性、发育特异性及组织特异性。,方法：从不同种属动物细胞来源的细胞系制备的细胞抽提液，分析同工酶的酶谱，会显示各自的典型带型。这些带型可作为细胞系的特征指标，用来检查细胞系细胞以及细胞系的来源。,90,4.4.2细胞系鉴定的方法,细胞谱系或组织的遗传标记分析,细胞DNA遗传特征分析,91,4.5细胞同步化,概念,：使细胞群中的绝大部分细胞“聚集”在细胞周期的同一时期，并使之同步进入细胞周期，这样的方法称为,细胞同步化,（cell synchronization）。,意义,：可获得大量同周期阶段的细胞，从而对其进行生化分析，深入了解细胞周期各个不同阶段细胞的结构与功能，以及研究细胞周期中有关基因的调控与表达等,92,4.5细胞同步化,方法：,分离同步化 诱导同步化,93,4.5细胞同步化,1,.,分离同步化,(1)G1、G2、S期细胞的分离,细胞分类拣选法 梯度沉降法2)M期细胞的分离,胰蛋白酶消化法 振摇脱落法,94,4.5细胞同步化,2,.,诱导细胞同步化,(1)G1期细胞的分离,a、低温处理法,(4,2-10h。),d、营养饥饿法,(2)M期细胞的诱导与分离,秋水仙素(终浓度0.051,g/mL),秋水仙胺(终浓度0.010.1,g/mL),95,4.6细胞冷冻,细胞冻存：,在培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）,浓度在,10,20,之间，可以降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。在-196的液氮中可长期保存。,96,要点,用慢冻快融的,方法,：标准的冷冻速度为-1-2/分，当温度达-25时，下降率可增至-5至10/分，到-100度时，则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快会影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成，但各种细胞对冻结速度要求也不一样。总之，在一开始时，下降速度不能超过-10/分钟。,最好冻存一年后，再复苏培养一次，然后再继续冻存。,97,冻存过程,98,4.7器官培养,意义和目的,由于其可以在体外维持器官的三维结构和特定的功能，消除了体内复杂的体液和神经等因素的影响，有利于独立研究某一器官的功能活动、分析影响器官功能的因素、了解器官内部不同组织间的相互作用；器官原基的培养，又可以使我们能更直接地观察和研究器官的形态发生、细胞分化等生命活动，这是细胞培养所无法替代的。,99,4.7器官培养,器官培养的基本原则,要使器官植块在体外培养过程中，保持正常的三维结构及其功能不变，必须注意两个基本,原则,：,1.必须给培养物提供充足的营养和氧气，并及时排除代谢废物,2.抑制细胞从外植块中迁移生长出来,可采取如下措施：将培养物放置在迁移时细胞难以有力粘附的表面上，如琼脂表面和网格状表面上；用一层薄的琼脂包被培养物，但此法已较少应用；把培养物经常转移到新的表面上。,100,4.7器官培养,器官培养的方法,1.表玻璃培养法,101,4.7器官培养,器官培养的方法,2.琼脂凝胶培养法,102,4.7器官培养,器官培养的方法,3.气液界面上的培养,103,4.7器官培养,器官培养的方法,4.滤纸虹吸器官培养法,104,4.7器官培养,器官培养的方法,5.循环培养液培养法,105,4.7器官培养,影响器官培养物发育和分化的因素,1培养环境,培养液中所补充的血清和胚胎抽提液的有无和相对比例，有时可影响培养器官的分化状态。如Grobstein发现小鼠胰腺上皮在含有10%20%胚胎抽提液的培养液中可继续分化，但若胚胎抽提液的含量增加到40%以上时，其分化则受到抑制。另外，把器官培养物放到不同的培养基质上，如琼脂、血浆凝块和擦镜纸等表面上，也会影响培养物的分化过程。,106,4.7器官培养,影响器官培养物发育和分化的因素,2团块效应,在器官培养中，团块效应(mass effect)(即细胞间的相互作用)是一种对分化过程有重要影响的作用因素。有人发现当鸡胚盘外植块的周径达到一定大小后，其神经分化便明显增强。也就是说，需要有足够数量的细胞，它们之间相互作用才会引起神经系统的分化,。,107,4.7器官培养,影响器官培养物发育和分化的因素,3不同组织间的相互作用,体外分离的胚胎原基的上皮并不会出现进行性的分化，除非这些上皮与适当的间充质发生相互作用。甚至有些上皮的这种组织间诱导作用特异性很高，上皮细胞只有和相同胚胎原基起源的间充质细胞接触才能分化。,另外，病毒、致癌剂等也会影响器官培养物的分化。,108,复习题,1 名词解释：原代培养 传代培养 细胞系 细胞株,2.试述动物细胞原代和传代培养方法,3.如果你在动物细胞原代培养中，遇到细胞不迁移或迁移生长缓慢的情况，你将采取哪些措施来解决？,4.体外培养动物细胞的形状主要有哪几种类型？,5.体外培养动物细胞的生长曲线有何特点？,6.对体外培养细胞进行常规检查主要有哪几方面内容？如何判断和排除微生物污染、病毒污染、化学污染和交叉污染？,7.为什么要对细胞系进行特性鉴定？鉴定方法有哪些？,8.体外培养细胞的细胞分裂是否同步？如何得到同步化的细胞？,109,