显微技术在生物科学的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,显微技术在生物科学的应用,2,一、电子显微技术在生物医学中的应用,电子显微镜技术是医学生物学工作者深入研究机体的超微结构及其功能的有利手段之一。所谓超微结构，一般指光学显微镜所不能分辨的组织、细胞的细微形态结构（亚显微结构）以及生物大分子的结构。随着现代医学细胞超微结构及分子生物学等学科的迅速发展，电子显微镜技术也正向超高分辨率、生物分子及原子水平发展。,*在形态学科,:,如解剖学、组织学、胚胎学、细胞学、病理学、微生物学、寄生虫学等等之中，电子显微镜技术已成为研究结构的常规方法。,*在某些机能学科,:,如生理、生物化学、病理生理、药理等。也应用电镜技术，探讨功能与结构的关系。,*在临床医学、环境保护科学以及中草药的研究等，电镜技术也起着重要作用,3,1,、电镜对病毒性疾病的诊断,病毒性疾病的诊断离不开电镜,电子显微术是确定各种病毒形态结构最有用的工具。传统的超薄切片可供观察感染细胞内病毒的大小、形态、排列及其复制组装、成熟的过程以及某些有包膜病毒的芽成熟的部位和病毒包涵体的形态特征。依据电镜下病毒形态结构特征,包括衣壳的对称性、壳微粒数和排列方式、,4,核衣壳在细胞内复制组装的部位、病毒体的形态和大小以及螺旋对称核衣壳的直径等,再结合病毒的核酸和蛋白分子生物学特性,可以对致病病毒进行鉴定和分类。电镜负染技术是一种快速简便的操作程序,也是病毒性致病因子电镜诊断常用方法,在新病毒的发现中作出了重要贡献。免疫电镜的应用更提高了病毒快速诊断的敏感性和特异性。,5,2,、电镜对肿瘤的诊断,病理科医生对肿瘤的诊断主要依赖于光镜辅以免疫组织化学等技术。一般讲,使用这些技术,绝大部分肿瘤都得以明确诊断。但有些肿瘤的诊断及鉴别诊断,电镜所起的作用很大,如无色素性黑色素瘤、肥大细胞肿瘤、嗜酸细胞瘤、肌源性肿瘤、软组织腺泡状肉瘤及神经内分泌肿瘤等对于这些肿瘤,光镜有时难以明确诊断。,6,免疫组织化学方法虽然对肿瘤的诊断发挥了很大作用,但由于肿瘤的多向分化及部分市售免疫组化试剂存在明显的交叉反应性,所以应用免疫组化染色诊断肿瘤有一定的局限性。而电镜技术的应用为肿瘤的诊断提供了一条新的途径。,7,3,、电镜对非肿瘤性疾病的诊断,电镜对各器官系统疾病的病理诊断,在许多单位受到重视,但用得最多的是肾脏活检和某些皮肤疾病的诊断。对肾脏病的诊断,通常将光镜、免疫荧光光镜和电镜观察三者结合。临床上,有时仅靠光镜难以对疾病明确诊断,而电镜具有高分辨性能,可以获得许多不为光镜捕捉到的信息,往往就是这些信息,为疾病的正确诊断提供了宝贵的资料,甚至修正光镜的诊断结论。有研究者对,200,例病例进行了光镜诊断和电镜诊断的结果比较发现有,15%,的病例靠电镜提供新的信息得以诊断。,8,大家应该也有点累了，稍作休息,大家有疑问的，可以询问和交流,9,二、荧光显微分析技术在植物细胞学研究中的应用,细胞进行自动调节或是适应外界压力时需要细胞器准确的定位与积极的运动,而它们的定位与运动到底是由何种物质引导,很长一段时期都不为人知。直到上世纪,90,年代,随着,LSCM,在细胞器动力学与细胞骨架的研究中的应用,人们才越来越清楚地了解到细胞器动力学中起重要作用的细胞结构是细胞骨架。与此同时,人们利用一些特异性荧光探针来研究细胞骨架在不同细胞生活状态下的分布,也取得了很大进展,。,1,、细胞器和细胞骨架的观察,10,人们才越来越清楚地了解到细胞器动力学中起重要作用的细胞结构是细胞骨架。与此同时,人们利用一些特异性荧光探针来研究细胞骨架在不同细胞生活状态下的分布,也取得了很大进展。,李岩等 采用免疫荧光定 位,在,LSCM,下观察,发现南瓜的茎细胞微管骨架排列主要有,三种方式,:,在一些薄壁细胞内,微管骨架是网络状排列,其中微管常常与液泡膜、核膜及质膜相连,;,而在多数伸长的细胞中,微管骨架往往是与细胞的纵轴成一定角度,并彼此平行排列,;,少数伸长细胞内,微管骨架形成束状,沿细胞纵轴排列,.,11,2,、细胞生理状态的研究,利用,Ca2+,荧光探针,Fluo3/AM,对花粉进行低温荧光标记后用,LSCM,研究了砂梨自花与异花授粉后至花粉萌发期间花粉胞内游离,Ca2+,分布的变化过程,结果表明,:,亲和授粉后随着时间的延长萌发孔附近,Ca2+,梯度因花粉胞内游离,Ca2+,浓度整体增大而消失,随后胞内游离,Ca2+,浓度又不均匀降,至萌发前在萌发孔附近的,Ca2+,梯度又重新建立,而不亲和花粉则没有这种特征性的变化。尚忠林等,21,对花粉游离钙离子的分 布特点进行研究使用,Fluo3/AM,进行标记,利用,LSCM,观察测定,12,结果表明,花粉萌发初期细胞质内游离,Ca2+,呈极性分布,萌发沟附近的,Ca2+,浓度明显高于其他部位,萌发孔附近最高,花粉细胞核中较低。在该条件下将,Fluo3/AM,导入拟 南芥叶细胞,利用激光共聚焦显微技术检测了胞内,Ca2+,荧光强度的分布研究表明茉莉酸处理能够诱导胞内游离,Ca,浓度的升高。使用铝敏荧光试剂标记大豆根尖细胞的铝离子,利用激光扫描共聚焦显微镜检测,发现铝对根尖细胞的分裂有抑制作用。,13,3,、细胞自发荧光的荧光强度测定,因烟草花粉、叶绿体和细胞壁等都能发出很强的自发荧光,故,可利用荧光分析仪器直接测定其荧光强度,来应用于各种相关领域的研究。应用,LSCM,对不同类型烟草材料的花粉自发荧 光强度进行了定量检测,发现不同类型及品种之间花粉自发荧光强度存在明显差异,可作为烟草品种鉴别的重要依据。叶庆华等 利用流式细胞仪测 定了红树植物秋茄成熟叶柄薄壁细胞的叶绿素含量与海水盐度之间的关系结果表明,海水盐度以,1.0%,为界,叶绿素含量在海水盐度小于,1.0%,时随其升高而增加,大于则下降。,Meyer,等,30,研究发现细 胞壁中的阿魏酸发出的蓝绿色荧光随着小麦叶龄的增长而减少,其荧光强度与叶绿素荧光强度的比率可以作为一种荧光探针来检测小麦的叶龄。,14,三、原子力显微镜技术及其在细胞生物学中的应用,15,对于原子力显微镜成像而言,样品在基底表面的固定是一个至关重要的问题,对于细胞样品来说尤其如此,.,如何将细胞样品固定得比较牢固又保持细胞的原始状态是许多研究者关心的重点,.,最初的报道中细胞一般都是经过自然干燥固定然后在空气介质中进行成像研究,.,自然干燥固定法是将一定量的细胞样品滴在基底上,然后在空气中自然干燥,干燥后形成一层平整连续的膜,.,这种固定方法非常简单,但是由于细胞在干燥过程中会脱水,因此对细胞形态等会有一定的影响,.,后来,如何在溶液状态下固定活细胞成为许多研究者工作的重点,.,1,、细胞固定方法研究,16,有研究者利用静电相互作用或共价交联等方法来固定细胞样品,.Bolshako,小组将基底表面进行聚赖氨酸修饰来固定细胞,在生理条件下细胞一般荷负电,而聚赖 氨酸荷正电,因此可以利用聚赖氨酸与细胞之间的静电相互作用固定细胞,.,这种细胞固定方法操作简单且重复性好,是目前为止用得最多的一种方法,.,不过,由于聚赖氨酸与细胞壁存在一定相互作用,因而对细胞结构还是存在一定的影响,.,17,2,、细胞成像,自从,20,世纪,90,年代初期,Butt,等人首次将原子力显微镜应用到细胞成像方面以来,陆续出现了很多关于细胞成像研究方面的报道,.,有研究者直接用原子力显微镜来观察细胞表面的超微结构,.Lister,等人采用自然干燥固定样品的方法对耐辐射球菌进行了,MAC,模式原子力显微镜成像研究,得到了高分辨的细菌表面形貌图,观察到了细菌表面压缩的六边形中间层,.,有些研究者则利用原子力显微镜对细胞的一些生化生理过程进行了研究,.,利用原子力显微镜观察到了白腐菌,表面微结构在发芽前后的变化,.,18,3,、力检测,原子力显微镜还有一个重要的特点,就是,在扫描得到样品表面形貌的同时还可获得样品表面某一特定点的力与距离的曲线关系,并根据此曲线得到黏附力、键合力等数据以及样品的机械性质,.,关于利用力与距离曲线关系进行力常数检测的报道很多三、原子力显微镜技术及其在细胞生物学中的应用小组在对静止和发芽孢子的表面结构和分子反应研究 中发现,19,力与距离的关系曲线显示孢子发芽过程中表面结构的变化与复杂的分子反应有关,:,静止孢子与,AFM,原子力显微镜针尖之间没有黏附力,而发芽孢子与针尖间则有很强的黏附力,.,他们还结合原子力显微镜和力谱对上述孢子表面大分子拉伸情况进行了定量测定,得到的结果与以前文献报道的单个右旋糖苷和直链淀粉多糖的弹性变形量一致,.,20,